一株偶发分支杆菌基因组文库的构建*

王铁峰,毛 冉,赵雪峰,钱爱东*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;2.吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118)

分支杆菌属内除结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合群和麻风分支杆菌(M.leprae)外,统称为非结核分支杆菌(Nontuberculous mycobacteria,NTM)[1-3]。目前对结核分支杆菌已经开展了深入的研究,但结核病仍是发展中国家主要发生的疾病之一。在我国各单项疾病调查中,结核病仍为首位死亡因素[4],其原因之一就是由于NTM的混合感染。NTM广泛存在于环境中[5],部分NTM对于人类和动物是条件性致病菌,能引起机体的多种组织病变[6-7],其中肺部的类结核样病变,常常引起结核病的误诊,而NTM对抗结核药物又大都具有耐药性,所以由NTM引起的结核病的误诊,给人类和易感动物健康造成威胁[8-9],对畜牧业的发展带来危害。然而,目前NTM的基础研究状况与其疫情极不相称,且远远落后于其他疾病,尤其在分子生物学和遗传学等方面。为此,本试验针对NTM中的致病菌即偶发分支杆菌(Mycobacterium fortuitum)构建基因组文库,可为实验室以后对NTM抗原及其他特征性基因的研究提供了实验素材,也可为针对NTM提出预防和免疫措施的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 从吉林省长春市某肉牛养殖场宰杀的牛淋巴结上分离出一株NTM,经生化方法和分子生物学方法鉴定为偶发分支杆菌(M.fortuitum)。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶Sau 3AⅠ、Bam HⅠ、去磷酸化酶FastAP、T4 DNA连接酶均为Fermentas公司产品,pUC18载体及其通用引物BcaBEST Primer RV-M和BcaBEST Primer M13-47为宝生物工程(大连)有限公司产品,Taq酶、质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为天根试剂公司产品,其他常用生化试剂均为北京化学试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养及基因组DNA的提取 用改良罗杰氏培养基于37℃扩增培养偶发分支杆菌(M.fortuitum),刮取整管细菌培养物转移至12 mL TE溶液中,80℃水浴灭活30 min。加入溶菌酶至终浓度2 mg/mL,置于37℃作用2 h,期间不定时轻轻摇匀,以利于完全反应,加入蛋白酶K至终浓度50 μ g/mL和100 g/L SDS至终浓度10 g/L,60℃作用2 h,期间不定时轻轻摇匀。将实验用吸液头无菌去尖,减少抽吸时对染色体DNA的机械损伤,用酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提2次,直至分液相处见不到沉淀,每次离心后短时间静置使气泡散去至上清澄清后吸取上清,再用氯仿/异戊醇(体积比24∶1)和氯仿各抽提一次,将上清移至小烧杯中,倒入2倍体积冷无水乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc,肉眼可见有絮状物析出,用玻璃棒挑取絮状物于离心管中,700 mL/L乙醇漂洗2次,每次6 000 r/min离心5 min,倒出上清,可见管底有白色沉淀,凉干乙醇,用蒸馏水室温溶解过夜,测OD值后于—20℃低温保存。

1.2.2 基因组DNA的最佳酶切反应条件的确定基因组DNA上有很多Sau 3AⅠ酶切位点,应用Sau 3AⅠ限制性内切酶对基因组DNA进行部分酶切,可以将基因组DNA随机地酶切至一定长度范围内的DNA片段,所得DNA片段长度范围是靠调整内切酶在酶切体系中浓度的方法来控制的,酶切预试验中取Buffer缓冲液38.8 μ L,基因组DNA 197.5 μ g,加无菌蒸馏水补充体系至368 μ L,混匀后分装至16管0.2 mL离心管中,其中第一管加入38 μ L,其余各管均加入20 μ L,取2 μ L Sau 3AⅠ内切酶(10 U/μ L),加入第1管中充分混匀后,从第1管中抽取20μ L加入第2管充分混匀做倍比稀释,以此类推倍比稀释至第16管,将16管酶切体系置于37℃水浴中1 h,65℃灭活内切酶10 min,5 g/L琼脂糖凝胶电泳,确定最佳酶切条件。

1.2.3 基因组DNA的部分酶切与回收 按照确定的最佳条件,取DNA 122 μ g进行部分酶切,电泳检测部分酶切效果后,凝胶回收1 kb～7 kb长度范围的DNA片段。

1.2.4 载体DNA的扩增 取pUC18环状载体0.25 μ g加入感受态DH5α细胞中混匀,冰浴30 min,42℃热激90 s,冰浴5 min,加入500 μ L LB培养液,37℃摇床200 r/min振荡培养50 min,取50 μ L涂布于LB琼脂平板上,37℃培养过夜,挑取白色单个菌落置于15 mL LB培养液中,37℃摇床120 r/min振荡培养10 h,离心收集菌体进行质粒的小量提取,电泳检测载体质粒的扩增结果。

1.2.5 载体DNA的酶切和去磷酸化 酶切反应体系为BamHⅠ5 μ L(10 U/μ L),载体DNA 5 μ g,buffer10 μ L,加水补至100 μ L,37℃水浴2 h,75℃水浴灭活10 min。

线性载体DNA去磷酸化反应体系为线性载体DNA 100 μ L,去磷酸化酶2 μ L,buffer 5 μ L,37℃水浴10 min,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测载体的酶切结果。

1.2.6 连接及转化 将已去磷酸化的线性载体pUC18(80 ng/μ L)与酶切回收的基因组DNA(200 ng/μ L)做体积比梯度混合,加T4连接酶至终浓度0.25 U/μ L,T4连接酶buffer 2 μ L,加双馏水补充体系至20 μ L,22℃连接过夜,取10 μ L连接产物加入到100μ LDH 5α中,混匀后冰浴30min,42℃热激90 s,冰浴5 min,加5倍体积LB培养液,37℃摇床120 r/min振荡培养50 min,涂布于含有AMP(0.1 mg/mL)、X-gal(20 g/L)和IPTG(200 g/L)的LB琼脂平板,37℃培养10 h,置于4℃0.5 h充分显色,挑取粟状白色菌落,用pUC18载体通用引物进行PCR检测,反应条件为94℃5 min预变性;94℃30 s,52℃30 s,72℃50 s,共30个循环;72℃10 min延伸.10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测连接效果。

2 结果

2.1 偶发分支杆菌染色体DNA纯度

测量酚氯仿抽提法提取的偶发分支杆菌染色体DNA纯度,稀释1 500倍测OD260为0.008 1,含量为0.607 5 μ g/μ L,OD260/OD280=1.81,电泳检测其分子质量在10 kb以上,说明DNA纯度较高(图1)。

图1 偶发分支杆菌染色体DNAFig.1 The DNA ofM.fortuitum

2.2 基因组DNA酶切条件的确定及回收结果

根据琼脂糖电泳结果得知当酶与DNA比例为0.015 U/μ g时,37℃水浴1 h,65℃灭活10 min后所得DNA片段较为合适,大部分集中在1 kb～7 kb之间,使用DNA回收试剂盒切胶回收1 kb～7 kb大小的DNA片段(图2)。

2.3 酶切与去磷酸化结果

克隆扩增的pUC18载体,质粒提取检测与原载体大小相同,经过酶切、去磷化处理,电泳结果也与线性载体相同(图3)。

2.4 线性载体DNA与外源DNA片段的连接

在线性载体DNA与外源DNA片段体积比为1∶2时连接效率最高,当比例接近1∶5时,连接效率较低。

2.5 阳性克隆的结果

应用pUC18载体通用引物进行菌落PCR,电泳结果显示含有重组DNA片段的阳性结果均在1 kb～7 kb之间,阳性结果接近100%(图4)。

图2 DNA酶切条件Fig.2 The DNA digesting condition

图3 酶切载体与外源DNA片段Fig.3 The digested vector and DNA fragments

图4 阳性菌株PCR和部分阳性菌株小提质粒Fig.4 The results of PCR and plasmids of positive strain

2.6 基因组文库的构建

根据公式N=ln(1-P)/ln[1-(I/G)](其中N为转化子数,P为获得目的基因的可能性,一般为99%,I为克隆片段的平均大小,G为基因组大小,偶发分支杆菌基因组大小约为4×106bp),获得目的基因的可能性为99%时,所需的基因文库的克隆数量为2 629个～18 418个,共计获得阳性克隆大约4×104个,达到基因组文库要求。

3 讨论

3.1 基因组DNA的提取

由于分支杆菌细胞壁结构特殊,完整的高纯度的提取其基因组DNA存在一定困难[10],试验中经过多次尝试改进,将真核细胞核酸提取与原核细胞核酸提取方法结合,当无水乙醇沉淀核酸时,用玻璃棒挑取絮状核酸,这样可以将核酸DNA与乙醇中散在悬浮的蛋白分开,再用700 mL/L乙醇冲洗核酸,蒸馏水溶解核酸。此改进方法提取的分支杆菌核酸,溶解性好,OD260/OD280高达1.8左右,可以用于基因文库的构建。

3.2 基因组DNA酶切片段的回收

回收指定大小基因组DNA片段的方法主要有蔗糖梯度超离心法和透析袋法[11-12],较少用到琼脂糖凝胶电泳回收法,原因是该方法回收的片段长度有限,且回收效率较低,本试验通过改变DNA在吸附柱中的吸附时间、重复多次用一份去离子水洗脱的方法,提高DNA片段的回收效率,同时注意操作过程中吸液头去尖,最大限度的减小大片段DNA的断裂,经过改进的回收方法操作简便,不需要高成本的大型实验器材,短时间内就能获得高质量高纯度的DNA片段,降低了实验难度,加快了实验进程,也可以为同类需要获得大片段核酸的实验所借鉴。

3.3 线性载体与外源DNA的连接

连接反应中,小片段DNA的连接效率要高于大片段DNA,为了提高大片段DNA的连接效率,使基因组文库含盖率增加,试验中设置了线性载体与外源DNA连接反应比例梯度,最后证实,当载体与外源DNA体积比达到1∶2时,连接所得重组子最多,其中大片段DNA与小片段DNA连接效率最为接近,而当比例小于1∶2时,阴性克隆增加,当比例大于1∶2时,连接反应效率降低,所得阴、阳性克隆均明显减少。

3.4 阳性克隆的筛选

选用菌落PCR检测阳性克隆结果,试验操作简便、快捷,所需成本要远远小于酶切鉴定试验。通过琼脂糖电泳检测,结果较为满意,所以PCR方法对基因组文库鉴别是首选方法。

3.5 基因组文库的保存

基因组文库的保存常常选用刮取所有克隆于超低温保存,也有选择96孔细胞培养板对每个克隆独自保存的,本试验采用前一种方法,但是这些保存方式对温度条件要求严格,处于液态的基因文库体积较大,不利于文库的交流使用,所以本实验目前正在尝试对所建文库采用真空冷冻干燥技术保存,已经进行长期保存和定期复苏检验阶段,现在还没有将该技术用于基因组文库菌种保存的实验报道,此技术保存文库菌种成功后,将克服温度控制、保存体积等方面的缺点,更有利于基因文库的长期稳定保存和交流使用。

3.5 基因组文库的意义及发展

自从20世纪70年代Clarke J E等[13]提出基因组文库的概念以来,随着越来越多高效稳定的载体的构建,越来越多的生物基因被用基因组文库的方式保存起来,这种离体保存生物基因的技术可使生物基因长期稳定的得以保存,并为各科研机构的交流提供方便,同时也大大加快了科研进程,其做为一种遗传和分子生物学研究手段也更多的应用于人类基因的研究工作。Young R A等[14]和ClarK-Curtiss J E等[13]分别构建结核分支杆菌和麻风分支杆菌基因库以来,越来越多的基因组文库被用来研究结核分支杆菌,而对于NTM的研究目前还没有建立基因组文库的报道,所以本试验就NTM中致病性菌株偶发分支杆菌建立了基因组文库,所含克隆数足以覆盖偶发分支杆菌的全部基因,该文库的建立为以后对该菌致病基因、耐药基因、抗原有关基因等方面的研究及基因结构和调控等研究打下良好基础[15-16],同时也为其他NTM的研究工作奠定了一定的技术和理论基础。

[1] Wallace Jr R J,Cook J L,Glassroth J,et al.American Tho racic Society statement:diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria[J].Am J Respir Crit Care Med,1997,156:S1-S25.

[2] Griffith D E,Aksamit T,Brown-Elliott B A,et al.An official A TS/IDSA statement:diagnosis,treatment,and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175:367-416.

[3] Field S K,Cowie R L.Lung disease due to the more common nontuberculous mycobacteria[J].Chest,2006,129:1653-1672.

[4] 孙泉云,王根龙,陈 琦,等.野生动物结核病研究进展[J].动物医学进展,2010,31(8):93-97.

[5] 杨建华,马丽萍.非结核分支杆菌感染现状和治疗的探讨[J].医药论坛杂志,2004,25(17):3-4.

[6] 刘 相,陈海峰,杜月菊,等.分支杆菌不同菌型的耐药结果分析[J].河北医药,2007,29(12):1395-1396.

[7] 刘 相,陈海峰,魏喜玲,等.结核分支杆菌耐药结果分析[J].河北医药,2010,32(15):2112-2113.

[8] Michelarakis J,Varouhaki C.Osteomyelitis of the calcaneus due to atypical Mycobacterium[J].Foot and Ankle Surgery,2009,15:106-108.

[9] Alagarswamy R K,Halfpenny W,Thiruchelvam J K,et al.Rare presentation of Mycobacterium avium-intracellulare infection[J].Brit J Oral Max Surg,2007,45:670-672.

[10] 王海军,陈 迪,王春雨,等.分支杆菌DNA的不同提取方法在PCR反应中的定性评价[J].经济动物学报,2010,14(2):107-112.

[11] 蔡 宏,陈 东,李淑霞,等.牛结核分支杆菌基因文库的构建[J].中国预防兽医学报,1999,21(2):114-116.

[12] 桓明辉,陈 飞,吴红艳,等.不吸水链霉菌基因文库的构建及初步筛选[J].生物技术通报,2009(1):134-137.

[13] Clark-curtiss J E,Jacobs W R,Docherty M A,et al.Molecular analysis of DNA and construction of genomic libraries of M.leprae[J].J Bacterio,1985,1(161):1093.

[14] Young R A,Bloom B R,Grosskinsky C M,et al.Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA[J].Proc Natl Acad SciUSA,1985,82:2583.

[15] 林祥梅,薛 梅,韩雪清.牛分支杆菌主要保护性抗原研究进展[J].动物医学进展,2009,30(6):86-90.

[16] 严懿嘉,朱建国,刘 芳,等.分支杆菌分泌蛋白研究进展[J].动物医学进展,2008,29(3):64-67.