盐胁迫对白三叶叶肉细胞超微结构的影响

殷秀杰，胡宝忠，崔国文，李凤兰，李景欣，王明君，洪锐民

（1.东北农业大学动物科学技术学院, 哈尔滨 150030；2.东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030）

白三叶（Trifolium repens L.）是豆科三叶草属多年生牧草，是世界上非常著名的优良栽培牧草，同时作为温带地区混播人工草地和观赏性草坪建植的主要草种，将会随着我国畜牧业和城镇绿化的迅速发展而发挥越来越重要的作用，国内白三叶的研究应注重其耐盐碱性及持久性等方面的改良，提高其生态适应性，以利其在北方地区的推广和生产，尤其是在盐碱地难绿化的情况下，意义更为突出。

国内外关于逆境胁迫对植物细胞超微结构变化的研究亦有报道，大量研究发现逆境胁迫对植物细胞的膜脂过氧化有促进作用，主要表现在电解质渗漏率增大，叶绿体、线粒体等细胞器的超微结构破坏和叶绿素降解等[1-8]。目前，白三叶对盐胁迫的适应能力的研究还比较少，尤其是盐胁迫对白三叶超微结构的影响未见报道。本研究观察了盐碱胁迫下白三叶叶肉细胞超微结构的变化，为其在盐胁迫下出现的生理变化和耐盐性提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料培养

用长20 cm宽13 cm的塑料盆装2/3体积的珍珠岩，加500mL的Hoagland培养液至其表面湿润，将白三叶种子均匀地播撒其上，于室内培养。待幼苗长至3叶期时，模拟黑龙江省大庆地区盐碱土的成分及盐量，配制相应盐溶液，进行梯度盐胁迫处理如表1所示，未胁迫组为对照组，处理时用漏斗将溶液加至塑料盆底部，处理5 d后取幼苗倒数第2叶片中部进行透射电镜样品制备。

1.2 透射电镜样品制备与观察

取下的样品迅速放到2.5%戊二醛中进行前固定，真空泵抽气使材料下沉，并置于4℃冰箱中保存固定2 d。用pH 7.2磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min，再用2%四氧化锇固定1.5 h，用pH 7.2磷酸缓冲液再冲洗3次，每次10 min。分别用浓度为50%、70%、80%、90%、100%的乙酯进行脱水，每次10～15 min，100%的3次，其他浓度各1次。然后用100%乙醇∶丙酮=1∶1、纯丙酮各置换1次，每次10 min。用纯丙酮∶环氧树脂812包埋剂按1∶1、1∶2、1∶3各1 h、2 h、2～3 d浸透，浸透后将样品置于恒温培养箱中，40℃17 h、45℃24 h、60℃24 h聚合，用ULTRACUTE型超薄切片机进行切片,用醋酸双氧铀、柠檬酸铅在25℃下分别对样品染色15～20 min，用双重蒸馏水冲洗干净后放入培养皿中待检。在JSM25610LV透射电镜下观察拍照。

表1 试验含盐量及盐成分Table1 Salinity and salt composition of experiment

2 结果与分析

2.1 对照组白三叶叶肉细胞超微结构的影响

对照组白三叶的叶肉细胞排列疏松，各种细胞器结构完整，清晰可见。中央液泡膜完整，液泡充盈呈膨胀状态，与周围的细胞质紧密相贴。细胞核明显可见，细胞核核膜清晰，内部的染色质均匀分布。线粒体呈比较规则的球形或椭球形，在细胞质基质中少量分布，双层被膜结构完整，嵴清晰可见，呈随机排列（见图版Ⅰ-1）。叶绿体紧贴细胞壁，叶绿体内部片层清晰，排列有序，叶绿体外形为长椭圆形，并且具有少量的高电子密度的小球形脂质球，含少量的淀粉粒，叶绿体被膜和类囊体结构清楚（见图版Ⅰ-2、3）。

2.2 盐胁迫对白三叶叶肉细胞超微结构的影响

轻度盐胁迫下，叶绿体结构正常，基本不受影响，表现了白三叶对盐胁迫有一定的耐性（见图版Ⅰ-4）。随着盐胁迫强度的提高，叶绿体结构受到不同程度的影响（见图版Ⅰ-5～7）。中度盐胁迫下，叶绿体基粒类囊体膨胀，间质片层空间增大（见图版Ⅰ-5）。基粒排列紊乱，随机分布于叶绿体中，此时部分叶绿体形状开始发生变化，由原来的长椭圆形变成球形，叶绿体中出现了大量的淀粉粒（见图版Ⅰ-6、9）。表明中度和重度盐胁迫对叶肉细胞中叶绿体结构的破坏较大，叶绿体结构的破坏与盐胁迫下叶肉细胞最终死亡密切相关。高度盐胁迫下，细胞质中产生许多膜状结构，观察到有些叶肉细胞被泡状结构所充满，看不到线粒体等细胞器（见图版Ⅰ-7），表明液泡和内膜系统在叶肉细胞器降解过程中起了重要作用。

2.3 盐胁迫对白三叶叶片基粒片层超微结构的影响

对照组白三叶基粒片层排列有序、紧密，基粒片层与叶绿体的长轴方向平行排列，基粒片层比较厚（见图版Ⅰ-8），表明植物进行光合作用的能力强。盐胁迫下白三叶叶片叶绿体内部的基粒片层膨胀溶解，排列疏松，部分模糊不清，基粒片层层数减少（见图版Ⅰ-9、10）；细胞内部分片层排列疏松，部分片层排列模糊不清，基粒片层膨胀溶解，外部被膜部分断裂，一些片层内部膨胀（见图版Ⅰ-10），表明叶片细胞已受到严重损伤，光合作用受阻。

2.4 盐胁迫对白三叶叶片线粒体结构的影响

轻度盐胁迫对线粒体的影响较小（见图版Ⅰ-12、13），线粒体具有清晰的被膜和管状的脊，随着盐胁迫的加强，部分线粒体开始发生变化，主要表现为线粒体嵴消失，线粒体肿胀，同时出现了叶绿体和线粒体彼此嵌合的现象。高度盐土培育下，线粒体被膜结构所包围，最终降解消失（见图版Ⅰ-14）。

图版Ⅰ 白三叶叶肉细胞超微结构PlateⅠ Ultrastructure of mesophyll cells in white clover

3 讨论

叶肉细胞中叶绿体是感受盐胁迫最敏感的细胞器，据报道，其结构的变化随盐浓度的不同而不同[1]，低盐浓度下，叶绿体的变化不明显，随着盐浓度的升高，叶绿体结构开始出现不同程度的破坏。目前关于盐胁迫对叶绿体超微结构的影响，已经在枸杞[2]、小麦[3]、葡萄[4]、芦荟[5]、杂交酸模[6]、水稻[7]、芦苇[9]、星星草[10]、马铃薯[11]等植物上进行了相关研究，研究发现盐胁迫导致类囊体排列紊乱、膨大，基粒排列方向改变，基粒和基质片层界限模糊不清，被膜破损或消失，甚至解体等。轻度盐胁迫下，白三叶叶绿体能维持其结构和膜的完整性；而重度盐碱胁迫后，叶绿体膜溶解，与韦存虚等在星星草中的研究得到的结论基本相似[10]。重度盐胁迫下白三叶草叶绿体及类囊体，基粒片层和基质片层明显变形。

重度盐胁迫下白三叶叶肉细胞叶绿体中出现较大颗粒的淀粉粒，与侯江涛对扁桃砧木[12]、刘吉祥对芦苇[9]和朱宇旌等对小花碱茅[13]研究发现的结果一致。淀粉粒的积累是由于盐胁迫导致细胞代谢水平降低，生理活性降低，同化物的运输系统遭到破坏造成[14-16]。淀粉是细胞的重要能源之一，生长在盐生环境中的植物，由于受到了盐分的影响，各细胞器在盐分的影响下可能难以充分发挥各自的功能，会使植物生长受阻，光合产物以淀粉形式累积下来，提供能量，保证植物很好生长，这也许是适应生境的表现，可能是一种抗盐形式，也可能与高浓度盐碱阻碍了淀粉的水解和向外运输有关[17]。

4 结论

白三叶叶肉细胞的细胞器对盐胁迫的敏感性和耐受性是不同的。所有细胞器都能耐受轻度盐胁迫，但对中度和重度盐胁迫，却表现出不同程度的伤害，重度盐胁迫下白三叶草细胞膜系统、叶绿体、线粒体、细胞核等结构上都有着明显变形。盐胁迫下白三叶叶绿体结构的破坏与叶肉细胞最终死亡密切相关。

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