芹菜素对大鼠阿霉素性心肌损伤的影响

王 仙,于肯明

阿霉素(Adriamycin,ADR)属于蒽环类抗生素,广泛应用于急、慢性白血病,淋巴瘤以及各种实体瘤的治疗过程中。但是,随着阿霉素使用的增加,急慢心肌损伤成为其临床应用的主要障碍[1,2]。芹菜素(Apigenin,API)是一种黄酮类化合物,广泛存在于各种水果、蔬菜和某些植物中,具有神经保护、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用。越来越多的研究提示,芹菜素可通过多种途径发挥对心血管系统损伤的保护作用[3-5]。本实验通过制备大鼠阿霉素性急性心肌损伤模型,来观察芹菜素在大鼠阿霉素性心肌损伤中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药品、试剂、仪器 阿霉素,浙江海正药业股份有限公司(批号:20081107);芹菜素,陕西慧科植物开发有限公司(批号:AP20070823);T LR4免疫组化试剂盒,购自武汉博士德生物工程公司;CK-MB的ELISA检测试剂盒,购自上海越研生物科技有限公司。显微镜及图形分析系统、多功能酶标仪等。

1.1.2 实验动物 健康雄性SD大鼠40只,清洁级,体重200 g～250 g,由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 雄性SD大鼠40只,随机分为5组(每组8只):CONT ROL、ADR、ADR+API[L]、ADR+API [M]、ADR+API[H]。ADR+API各组于实验开始的第一天起每天分别腹腔注射7.5 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg的芹菜素,共5 d;CONTROL组和ADR组每天注射等体积的生理盐水,共5 d;除CONT ROL组外,其他实验组均于实验的第6天一次性腹腔注射15 mg/kg阿霉素。CONT ROL组注射等体积的生理盐水。所有实验动物均于实验第8天采血后使用断头法处死。

1.2.2 病理组织学观察 剪取部分游离左室壁组织,10%甲醛固定;常规石蜡包埋,切片4μ m。取制作好的切片,HE染色,光镜下作组织病理学观察。

1.2.3 心肌细胞TLR4的免疫组化检测 取制作好的石蜡切片,常规脱蜡至水,3%H2O2消除内源性过氧化物酶,0.1%胰蛋白酶进行抗原修复,以TLR4一抗4℃过夜,二抗室温孵育, DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。免疫组化阳性反应为细胞浆内具有棕黄色颗粒沉积。在400倍的视野下,每张切片随机选择10个位点,对其染色强度进行自动分析,结果用灰度值表示。

1.2.4 血清心肌酶检测 严格按照CK-MB的ELISA试剂盒说明操作,按序进行标准品的稀释与加样、温育、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色等。

2 结 果

2.1 心肌组织光镜下病理形态学观察 在光镜下,CONTROL组心肌细胞排列整齐,横纹清晰可见,细胞间隙正常;ADR组的心肌细胞横纹模糊消失,心肌纤维出现扭曲、断裂,细胞间隙明显增宽;ADR+API各组,中剂量、高剂量组心肌损伤表现明显改善,心肌纤维断裂的程度明显轻于ADR组,而低剂量组表现不是很明显。

2.2 心肌细胞TLR4免疫组化灰度值(GREY)变化 与CONTROL组比较,ADR组的GREY值明显降低(P＜0.01);与ADR组比较,ADR+API各组的GREY值升高,ADR+API (L)组的GREY值升高不明显;ADR+API(M)与ADR+API (H)两组的GREY值升高明显(P＜0.01)。详见表1。

2.3 血清心肌酶CK-MB改变 与CONTROL组相比较, ADR组的CK-MB值明显升高(P＜0.01);与ADR组相比较, ADR+API各组的CK-MB值降低,ADR+API(L)组的CK-MB值降低不明显;ADR+API(M)与ADR+API(H)两组的CK-MB值降低明显(P＜0.01)。详见表1。

表1 芹菜素对G REY,CK-M B变化的影响( ±s)

表1 芹菜素对G REY,CK-M B变化的影响( ±s)

?

3 讨 论

阿霉素是一种抗瘤活性强的蒽环类化疗药物,目前被广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗。当阿霉素累积量＞550 mg/m-2时,心衰发生率高达26%,而使用剂量达到700 mg/m2时,心衰发生率高达48%[6]。探讨阿霉素心肌损伤的机制,并寻求解决的办法一直是学术界研究的热点。阿霉素心肌损伤的机制可能涉及了多个方面,包括氧化应激、细胞凋亡、基因及转录水平的改变等[7-10]。免疫炎性损伤可能在阿霉素心肌损伤中发挥了重要作用[11,12]。本实验采用给大鼠一次性腹腔注射阿霉素 15 mg/kg制备阿霉素急性心脏损伤模型[13],并探讨芹菜素低(7.5 mg/kg)、中(15 mg/kg)、高(30 mg/kg)三个剂量对阿霉素急性心脏损伤的影响。给予大鼠一次性腹腔注射阿霉素15 mg/kg后,ADM组的大鼠心肌细胞,出现心肌纤维的扭曲和断裂,而且在血清CK-M B、心肌细胞TLR4免疫组化检测方面,ADR组与CONTROL组相比较,差异具有显著性,表明阿霉素急性心脏损伤模型制作成功。而在提前给予5 d的芹菜素组,尤其ADM+API(M)与ADM+API(H)组的各项指标均改善明显,表明芹菜素可以减轻阿霉素所导致的心肌损伤。TLR4是近几年发现可能参与许多心血管疾病的受体,Alexander等[12]发现TLR4基因敲除鼠,其多柔比星所造成的心肌损伤减轻,而且束进等[14]通过在体外心肌细胞培养损伤模型中发现,多柔比星作用于乳鼠心肌细胞2 h、6 h后TLR4表达明显增加。本实验结果亦显示,与CON TROL组相比较,ADR组的TLR4表达明显增高;与ADR组相比较,ADR+API(M)与ADR+API(H)两组TLR4的表达明显下降,提示阿霉素所导致的心脏损伤可能与TLR4的过度表达有关。

芹菜素可减轻阿霉素性心肌损伤,可能与其对心肌细胞TLR4表达的影响有关,但其确切机制还有待于深一步研究。

[1] James H,Doroshow.Doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].N Engl J Med,1991,324:843-845.

[2] Hequet O,Le QH,Moullet I,et al.Subclinical late cardiomyopathy after doxo rubicin therapy for lymphoma in adults[J].J Clin Oncol, 2004,22:1864-1871.

[3] Xin M a,Yan F,Li QG,et al.Inhibition of superoxide anion-mediated impairment of endothelium by treatment with luteolin and apigenin in rat mesenteric artery[J].Life Science,2008(83):110-117.

[4] 陆景坤,王丽伟,董乃维,等.山萘酚、芹菜素、大豆苷元对 H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响[J].哈尔滨医科大学学报,2007,41(4): 309-312.

[5] 张慧芝,白建平,于肯明.芹菜素对缺血再灌注大鼠心肌核转录因子-κ B和ICAM-1表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(2):181-184.

[6] Swain SW,Whaley FS,Ewer MS.Congestive heart failure in patients treated with doxorubicin:A retrospective analysis of three trials[J].Cancer,2003,97(11):2869-2879.

[7] Davies KJ,Doroshow JH.Redox cycling of anthracyclines by cardiac mitochondria,anthracyline radical fo rmation by NADH dehydrogenase[J].J Bio Chem,1986,26(7):3060-3067.

[8] Nakamura T,Ueda Y,Juan Y,et al.Fas-mediated apoptosis in adriamycin cardiomyopathy in rats in vivo study[J].Circulation, 2000,102(5):572-578.

[9] Shizukuda Y,Matoba S,Mian OY,et al.Targeted disruption of P53 attentuates doxorubicin-induced cardiac toxicity in mice[J]. M ol Cell Bio Chem,2005,273(1-2):25-32.

[10] Boucek RJ,Miracle A,Aderson M,et al.Persistent effects of dox orubicin on cardiac gene ex pression[J].Mol Cell Cardiol, 1999,31(8):1435-1446.

[11] Nozaki N,Shishido T,Takeishi Y,et al.Modulation of doxo rubicin-induced cardiac dysfunction in toll-like receptor-2-knockoutmice[J].Circulation,2004,110(18):2869-2874.

[12] Alexander R,Sandra B,Matthias G,et al.Toll-like receptor-4 deficiency attenuates doxorubicin-induced cardiomyopathy in mice [J].Eur J Heart Failure,2008,10(3):233-243.

[13] Shufeng Li,Mingyan E,Bo Yu.Adriamycin induces myocardium apoptosis through activation of nuclear factor-κ B in rat[J].Mol Biol Rep,2008,35:489-494.

[14] 束进,严文华,王海波,等.多柔比星对乳鼠心肌细胞 TLR4/NF-κ B信号通路的影响及地塞米松的干预实验研究[J].江苏大学学报, 2009,19(6):480-484.