免疫传感器在食品真菌毒素检测中的应用

韩鹏飞，李洪军，2，*，邹忠义

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆400715)

免疫传感器在食品真菌毒素检测中的应用

韩鹏飞1，李洪军1，2，*，邹忠义1

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆400715)

真菌毒素污染是造成粮食和食品安全问题的重要因素之一。传统的分析检测技术如色谱分析法、免疫化学法等用于真菌毒素检测中具有耗时长、样品前处理繁琐等特点。本文介绍了采用生物免疫传感器快速检测真菌毒素的方法，主要综述了它们在各类粮食、食品等基质中真菌毒素检测的应用现状，并简要分析了该技术存在的不足，对其应用前景做出了展望。

真菌毒素，免疫传感器，快速检测，应用，问题

真菌毒素是存在于食品和粮食中能直接引起人或动物病理变化或生理变态的霉菌代谢产物。发霉很严重的物质不一定有较高含量的霉菌毒素，而那些看起来发霉不严重的材料可能含有大量的霉菌毒素，对霉菌的研究重心开始转移到霉菌毒素上来，霉菌毒素已经成为品质评定的指标之一［1］。强化真菌毒素的检测力度，直接关系到保障人们的身体健康和生命安全，也是提高我国农副产品国际市场竞争力的重要措施。目前真菌毒素的检测方法有多种，包括薄层层析法(TCL)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫化学分析法等，但它们都有程序复杂、检测周期长等特点。传感器技术正逐渐应用于真菌毒素的检测中，以其耗时短，样品前处理简单等特点成为真菌毒素快速检测中的新兴技术。

1 免疫生物传感器的基本原理

免疫传感器是基于固相免疫分析的生物传感器，它是一种微型化检测装置，能够通过抗体选择性地检测待检物质并产生与待检物质浓度相对应的可转换信号。免疫传感器作为一项结合生物学与物理学的新技术而受到青睐。

免疫传感器的工作原理和传统的免疫分析技术相似，即把抗原或抗体固定在固相支持物表面，通过抗原抗体特异性结合来检测样品中的抗体或抗原。不同的是，传统免疫测试法的输出结果只能定性或半定量地判断，一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时监测，并且所需测定时间较长。而免疫传感器有能将输出结果数字化的精密换能器，将抗原抗体结合时产生的电学、化学、光学等变化转化成可捕捉信号进行显示分析，不但能达到定量检测的效果，还有利于对免疫反应进行动力学分析，同时缩短了测定时间。由于抗原与抗体的特异性强，减少了非特异性干扰，大大提高了检测的灵敏度和准确性，同时扩大了检测范围［2］。

2 生物免疫传感器在真菌毒素检测中的应用

真菌毒素分子没有特殊的可供化学方法直接分析的基团，但是大多数毒素本身具有与大分子蛋白质结合的能力，从而赋予其抗原性，能在体内产生相应的抗体。以抗体抗原专一性结合为基础，加之各种免疫标记技术的发展，使抗体免疫传感器成为检测毒素的有效装置［3］。目前用于食品真菌毒素检测的传感器种类有电阻抗生物传感器、热导率传感器、电化学传感器、压电免疫传感器和光免疫传感器等。

2.1 电阻抗免疫传感器

Radi［4］等人将电阻抗免疫传感器用于赭曲霉素A的敏感检测。首先通过电化学还原生成的衍生物在原位4苯甲酸在酸性水溶液中重氮盐产生了稳定的4羧基单层，赭曲霉素A单克隆抗体利用碳二亚胺进行固定。赭曲霉素A和固定于传感器表面的抗体之间的免疫化学反应情况，利用循环伏安和电化学阻抗谱进行详细描述。发生于免疫传感器表面的免疫交互作用引起电阻改变，以此来检测赭曲霉素A。电子转移电阻值与OTA浓度呈线性正比关系，检测浓度1～20ng/mL，检测限为0.5ng/mL。

2.2 热导率免疫传感器

Liu等［5］设计了一个新型测量导热率的免疫传感器来检测AFB1，他们将辣根末(山葵的根制成的香辛料)过氧化物酶和AFB1抗体分子结合到功能性金纳米微电极上，通过其测量传导性来检测AFB1。随后抗体和抗原形成的免疫复合体作为一个屏障，阻挡了固定化酶和电极表面接触，通过毒素浓度的改变其传导性也发生相应的改变。这种技术的检出限为0.1ng/mL。这种免疫传感器除了免标记之外，还能够小型化和大规模生产，能够成为一种方便，性价比高的检测设备。

2.3 电化学免疫传感器

一些真菌毒素的电活性特点使得我们可以利用电化学方法对其进行检测。Li等研究了一种将黄曲霉毒素氧化酶固定于多层碳纳米管上，基于电流测量的生物传感器来检测AFB1，将黄曲霉毒素氧化酶包埋在溶胶凝胶中，与多层碳纳米管改良的铂金电极相连。AFO和NWCNTs间的共价键维持酶活性并且对 AFB1的氧化做出响应。最低检测限为1.6nmol/L，平均响应时间为44s［6］。

Nagwa等［7］设计了一种电化学免疫传感器，该传感器是建立在间接竞争的 ELISA法的基础上，使用微分脉冲伏安法测定大麦中的AFB1，检测限可达30pg/mL，且具有较高的回收率。Nancy等［8］采用多层碳纳米管改良的玻璃碳电极，将其与连续流动装置相结合后制成的免疫传感器用于玉米中的玉米烯酮毒素检测。检测过程耗时15min，其检测限和灵敏度都优于ELISA方法。

结合纳米技术的的电化学免疫传感器也被研究用于真菌毒素分析检测中。Yao［9］等人用改良后的黄曲霉脱毒酶、多层碳纳米管建立了一种杂色曲霉素电化学传感器。碳纳米管具有特定的表层，不仅能够起到固定大量酶的作用，增加了固定化酶和基质反应的面具;还能够促进电子的转移，具有高电导性，提高传感器响应度。其检测限更宽，并且其LOD比通过 TLC和 HPLC－MS方法得到的要低。Anees［10］等人采用一种纳米锌氧化物平台完成了对真菌毒素的检测，将纳米锌氧化物薄膜与铟锡氧化玻璃结合，共同固定化兔免疫球蛋白单克隆抗体和牛血清蛋白，检测赭曲霉素A。X射线的衍射结果显示形成的纳米氧化锌颗粒的平均直径为5nm。傅立叶变换红外光谱、扫描电子显微镜、电化学阻抗谱用于表征纳米氧化锌/铟锡氧化物电极和牛血清蛋白/兔免疫球蛋白/纳米氧化锌/铟锡氧化物电极。电化学阻抗对后者电极的响应作为一个函数获得OTA的线性浓度为0.006～0.01Nm/dm3，检测限为0.006nm/dm3，响应时间 25s，灵 敏 度 189Ω/nm/dm3· cm－2，回 归 系数0.997。

尽管电化学免疫传感器具有响应时间短等优点，但样本的温度，离子浓度和pH等对传感器的灵敏度和稳定性存在一定的影响。

2.4 压电免疫传感器

压电免疫传感器是将抗原或抗体固定在石英晶体表面，由于免疫反应抗原(或抗体)与待测物中抗体(或抗原)发生特异性结合，可引起质量的变化，从而引起晶体振荡频率的改变，可通过信号监测器直接读出，得到待测物固定前后频率的变化值ΔF，再根据Sauerbrey提出的质量和频率的平衡方程ΔF=KF2Δm/A［11］，得到所测物质的质量。

压电装置(例如石英晶体微量天平)是不需要任何标记和分离处理的。Nabok［12］等尝试用压电免疫传感器来检测T－2毒素，得到的结果比理论预期要好得多。这个异常现象被认为是由于大量疏水的T－2分子(例如胶束)，也可能同时包裹了甲醇分子，一起作为溶剂。从而能够成为大分子而被检测到。但压电免疫传感器存在特异性不高，晶体在使用数次后不稳定等问题，有待进一步的研究。

2.5 光学免疫传感器(光生物传感器)

不同的光学转换方法用于真菌毒素的检测中，一些方法(例如荧光)需要一个标记分子，其他(如表面等离子体共振(SPR))仅依靠传感器表面的质量浓度的变化。其原理为通过测量折射率的变化来检出毒素，对分子量在10kDa以上或者具有高折射率的分子能够直接检出。目前的研究多集中在研究灵敏度更高的等离子体共振装置。

2.5.1 表面等离子体共振生物传感器 表面等离子共振(SPR)技术在制药、生物治疗和生命科学研究中的应用已经有多年时间，近年在食品分析检测领域，例如维生素、兽药测试和贝类毒素的检测中发挥了重要的作用。

SPR被用于检测B型单端孢霉烯族毒素。Julie P.Meneely等［13］人采用涂有HT－2毒素衍生物和单克隆抗体的传感器芯片的快速表面等离子体共振检测技术能够对T－2和HT－2毒素进行复合检测，HT－2抗体表现出与T－2毒素的高度交叉反应，但与其他常见的单端孢霉烯族毒素未见交叉反应。

基于表面等离子体共振的间接竞争免疫传感器已经用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)［14］和AFB1［15］的检测，AFB1检测限为3.0ng/mL。对实际样品的分析结果与采用色谱分析方法的结果一致。

Tudos等［16］将酪蛋白与小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)共价连接制成人工抗原固定在芯片上，通过检测溶液中的DON抗体与固相抗原结合以SPR技术检测反应信号，构建了可以对DON进行定量分析的免疫微阵列，最佳检测限范围为2.5～30ng/mL，检测结果与使用气质联用(GC－MS)检测相一致。检测用传感器可以重复使用500次，而且不需要复杂的样品净化过程。

JingYuan等［17］人介绍利用表面等离子体共振生物传感器检测谷物和饮料中的赭曲霉素，采用固定于自制单层膜上的微粒子来加强信号。浓度低至1.5ng/mL的赭曲霉素能够用这种方法直接检测出来。采用纳米金粒子(40nm)作为信号加强能使其检测限达到0.042ng/mL。谷物样品采用50%甲醇进行处理，液体样品用3%或者5%的聚乙烯吡咯烷酮直接处理，省去了样品的前浓缩等步骤。燕麦和玉米中的LOD分别为0.3ng/mL和0.5ng/mL。在葡萄酒和其他饮料中的LOD范围0.058～0.4ng/mL。

2.5.2 其他光学免疫传感器 对于小分子物质的检测，基于全内反射椭圆偏振技术(total internal reflection ellipsometry，TIRE)的光学检测技术能够达到更高的准确性和灵敏度。TIRE用于T－2毒素的检测，能够达到比SPR更低的检测限［18］。利用渐逝场理论，采用光波导管光谱，可以根据层厚度的变化来测定折射率的变化，能够测定粮食样品中的OTA和AFB1［19］。

基于荧光偏振技术的分析方法，其原理是利用测定溶液中荧光分子自转速率反映出不同的荧光偏振率从而对不同毒素进行检测。标记萤光团的真菌毒素微小分子，自转速率快，表现出低的荧光偏振率。但当与相应的抗体相结合形成高分子量的免疫复合体后，其自转速率下降同时荧光偏振率增加。这个规律适用于小麦中的DON，玉米中的伏马菌毒素以及多种谷物中的黄曲霉毒素［20－22］。这种简便快速的分析方法，无需对样品的清洗步骤，随着基质效应，交叉反应和提取技术等问题的解决，将成为真菌毒素的筛查方法。

Carlson等［23］研发出一种轻便、微型的免疫亲和荧光生物传感器，实现全自动、高灵敏、快速地定量AF，可测定的浓度范围为0.1～50μg/kg，一个样品只需2min就可完成测定。Carter等［24］人利用光纤免疫传感器测定花生和玉米抽提物中的AFB1，检测限可达0.05ng/mL。

3 免疫传感器在应用中存在的问题

生物免疫传感用于多种真菌毒素的检测都取得了良好的效果，而且还在食品添加剂、致病菌、农药残留和抗生素等检测中得到了应用［25］，但目前大部分还处于实验室开发应用阶段，主要存在以下几个方面的问题。

3.1 特异性问题

虽然抗原和抗体特异性很强，但是不能完全消除交叉反应和干扰。例如真菌毒素的化学结构中含有相同侧链或者基团的毒素在检测过程中交叉反应比较普遍。单端孢霉烯族毒素中的DON毒素和T－2毒素就存在交叉反应。

3.2 稳定性问题

在一些例如机械振动，不稳定电流等恶劣条件下，免疫传感器的稳定性会受到影响，甚至造成免疫识别元件的失效。压电免疫传感器的晶体虽然可以重复利用，但是经过几次使用后，其稳定性明显下降。样本的温度，液体样本的粘度，离子浓度和pH等对传感器的灵敏度和稳定性也存在一定的影响。

3.3 生物信号识别性问题

免疫传感器的识别元件通常只能够识别一到两种毒素分子，而实际生产中通常需要对一种食品基质中的多种真菌毒素进行检测分析，因此对免疫传感器的多种毒素同时识别检测的研究还存在不足。

3.4 便携、集成和现场适用性问题

生物免疫传感器由检测器、信号装换元件、电子测量装置以及电路等部分组成，有些还与计算机相连。多种装置的复杂性造成了其在实际生产中的应用受到限制。现场检测和便携的优势就没有充分发挥。

4 展望

尽管存在一些问题，生物免疫传感器还没有在工业中得以广泛应用，但它们应用于真菌毒素的分析检测中极具意义。

目前针对一些问题，已经研究出了新型材料用于免疫传感器的生物识别元件上:例如纳米材料，包括纳米金、纳米碳管和其他纳米复合物等，它们体积小，比表面积大，表现独特的光学，电学和异相催化特性;抗体酶、合成缩氨酸和蛋白质核酸在分子印记聚合物基础上的物理化学识别要素可以大量检测低分子量聚合物。分子印记聚合物更加稳定，活性的检测点也可以再生多次，造价便宜。此外，缩微芯片能够包含分析所具备的一切重要部分:样品处理、反应试剂、检测器等。一些缩微芯片实验室的技术已经市场化了，如基因芯片。芯片技术将越来越多地进入传感器领域，实现检测系统的集成化、一体化，以达到对食品的即时检测。

如果能够进一步解决生物物质的有效性和重复性等一些技术上的问题，与传统的分析方法共存，作为独立的方法;或者作为其他技术补充，能够以更低廉的费用分析更多的样品，对相应的真菌毒素进行更快速的定性定量检测，甚至可以插入生物组织或细胞内实现超微量在线快速跟踪分析。可以预见，随着性能的日趋成熟和品种的不断增加，生物传感器在真菌毒素的分析中具有广阔的应用前景。

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Application of immunosensors in detection of mycotoxins in food

HAN Peng－fei1，LI Hong－jun1，2，*，ZOU Zhong－yi1
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China;
2.Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Chongqing 400715，China)

The mycotoxin pollution is one of the main factors that induce safety problems.Traditional analytical techniques for detection of mycotoxin were time－consuming and always accompanied with tedious sample pre－treatment and so on.This paper introduced the use of bio－immunosensors for detection of mycotoxin，focusing on the applications of the approach to detect mycotoxins in various foods.Then the technical shortcomings were put forward，and discuss the prospect of its application.

mycotoxin;bio－immunosensors;rapid detection;application;problems

TS201.1

A

1002－0306(2011)04－0430－04

2010－09－13 *通讯联系人

韩鹏飞(1988－)，男，硕士研究生，研究方向:现代食品加工理论与技术。

国家973计划项目(2009CB118806)。