林麝熟制标本皮张DNA的提取及PCR分析

冯 慧， 冯成利， 刘晓农， 任 轶

(陕西省动物研究所， 陕西 西安 710032)

0 引 言

秦岭山脉中有较多的动物群，有些动物已成为濒危动物，有些动物凶狠不易靠近.为了发现濒危动物，人们在山脉中去寻找，花费了大量的人力物力，却很难得到成效.有些地方发现有野生动物的皮、肉出售，当执法部门检查时，出售者称为人工养殖的，执法人员很难区别人工养殖的还是野生动物，这为执法者提出了新课题.另外由于环境的变化，野生动物也不停地进行变异，通过DNA的推测可以发现动物变异的规律.皮张标本为DNA提取的材料是非损伤性取样的一种，是法医学、遗传进化和分子生态学研究的有效方法.馆藏标本取样方便而且相对于粪便和毛囊的非损伤性取样选材范围较广；还可利用不同年限的馆藏标本对动物的遗传变异及遗传多样性进行研究分析，为制定相关的保护措施提供理论依据[1].为此，我们对秦岭有蹄类保护动物遗传多样性及其变化进行了研究.本论文是其中的一部分.

1 材料与研究方法

1.1 样品采集与保存

首先采集陕西省动物研究所标本室内20世纪5、60年代的林麝熟制标本皮张和各森林公安送来的盗猎动物的新鲜肉.新采集的样品，放入冰袋低温保存，及时分装、贴标，然后放入-80 ℃冰箱保存.

1.2 DNA的提取方法

试验进行的同时使用抽提空管作为阴性对照，用新鲜肉做阳性对照.

1.2.1 林麝熟制皮张DNA提取

(1)从每个标本上剪取约0. 5 cm2的皮张，用1 mL 0.03 M Na2HPO4溶液在不断振荡条件下处理24 h，除去铬离子[2].

(2)将标本用浸泡液(10 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH8. 0)浸泡24 h，弃浸泡液，用剪刀尽量剪碎，置于1. 5 mL离心管内；向离心管内加入500μL Nuclei Lysis Sol′n(Promega)，24μL 0.5 M EDTA，3μL 20 mg/mL蛋白酶K，在55 ℃下存放 3～5 h.

(3)12 000 r/min离心5 min，取200μL上清液于另一离心管中；向离心管中加入200μL Tris-饱和酚(pH8. 0)，轻轻地摇动混合10 min， 12 000 r/min离心10 min，重复此步骤一次.

(4)将上清移至一个新的1. 5 mL离心管中，再加入200μL 氯仿，轻轻地摇动混合10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清并重复此步骤一次；取上清移入一个新的1. 5 mL离心管中，加入2. 5倍体积的冷无水乙醇，轻轻地摇动片刻，置于冰箱中于-20 ℃条件下冷冻3 h.

(5)13 000 r/min离心15 min，小心弃去上清；吸取200μL 70%乙醇洗涤片刻，13 000 r/min离心15 min，小心弃去上清，室温下打开离心管盖，使乙醇蒸发10～20 min.

(6)用30μL TE (10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA，pH8. 0)缓冲液室温下溶解DNA沉淀；用DNA定量提取纯化试剂盒(DNA IQTM系统Promega)进行二次提取[3].

为防止提取过程中外源DNA 的污染，用无菌滤纸代替皮质标本作阴性对照，提取方法与其它样品完全一样.

1.2.2 肌肉DNA提取

(1)剪取米粒大小肌肉组织，加入5% Chelex-100(Bio-Rad)悬浊液和2μL 20 mg/mL蛋白酶K，于56 ℃保温过夜.

(2)第二天早上取出，剧烈震荡5～10 s后，放入100 ℃震荡8 min，再剧烈震荡5～10 s.

(3)13 000 r/min离心3 min，取50μL上清液用于扩增反应.

1.3 DNA质量检测

1.3.1 紫外吸收与琼脂糖凝胶电泳检测

紫外吸收检测DNA的纯度：将提取后的DNA样品适当稀释，采用紫外分光光度计测定在波长260 nm与280 nm处的吸收值，根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度.

琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性：将母液各取5 μL，采用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测降解程度，根据相对分子质量标准判断分子大小，在凝胶成像仪上观察并照相.

1.3.2 PCR扩增

从皮张中提取的动物基因组DNA往往要用于PCR扩增等后续分子生物学操作[4]，DNA浓度和纯度对结果影响较大, 因此提取的总DNA能否很好应用于扩增也是检测DNA质量的一个重要方面.根据NCBI上提供的林麝mtDNA Cytb区碱基序列，引物为L：5′-CAACTAACCTCCCTAAGACTTCAAG-3′， H：5′-CCAAATGTATGACAGCACAGTTATG-3′.采用25μL反应体积：10×缓冲液2.5μL，1.5μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5μL dNTP(10 mmol/L)，引物(10μmol/L)各取1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL)，1μL模板总DNA.PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min，35循环；68 ℃延伸10 min.反应后4 ℃保存.

1.3.3 DNA扩增片段的测序

PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，扩增效果较好的样品经凝胶回收试剂盒回收后送上海英骏生物技术有限公司进行测序.

2 结果与分析

紫外吸收值的结果显示，熟制标本皮张和新鲜肌肉提取到的DNA测得的OD260/OD280值均在1.75～1.85之间，这一结果表明熟制标本皮张和新鲜肌肉都能提取到纯度较高的DNA.

将提取到的DNA,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测,加10μL DNA原液,结果见图1.由图1可见，熟制标本皮张DNA含量非常少，而且有降解现象；新鲜肉DNA没有降解.

将扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2.5个样品中共有4个样品有扩增产物，扩增产物量少，条带亮度远低于新鲜肉扩增产物.

图1 皮张DNA和新鲜肉DNA电泳结果 图2 皮张DNA和新鲜肉DNA Cytb扩增结果

图1中1为DL2000标准分子质量标记，从上到下片段大小分别为2 000、1 000、750、500、250和100bp,每个条带的DNA量为50 ng；2、3、4、5、9为熟制标本皮张总DNA；6、7、8为新鲜肌肉总DNA.

图2中1为DL2000标准分子质量标记，从上到下片段大小分别为2 000、1 000、750、500、250和100bp,每个条带的DNA量为50 ng；2、3、4为肌肉mtDNACytb扩增结果；5、7、8、9、10为熟制标本皮张mtDNA扩增结果；6为空白对照.

对4份有条带的PCR扩增产物测序，结果均为400bp.与NCBI上林麝Cytb序列(GI:4 587 194)对比同源性为99%，说明使用所提取出的DNA作模板时, PCR扩增并不受到微生物DNA的影响.

紫外吸收值测DNA浓度时发现新鲜肌肉和熟制标本皮张的OD值差不多，但扩增和电泳结果表明熟制标本皮张DNA含量明显低于新鲜肌肉.由于熟制皮张核DNA多数已经流失、降解，而且提取过程中杂质不易清除，所以影响紫外吸收值.因此，标本皮张DNA浓度不易用紫外吸收值来测定.

DNA-胶原蛋白形成的是交联复合物[5]，熟制的皮张仍含有少量的DNA[6，7]，由于熟制的皮张含的DNA少，提高胶原蛋白的消化效果，把真皮成分胶原纤维彻底消化掉，才能将DNA释放出来；在皮张预处理时，尽可能减成小块，使其能够消化完全.用Promega裂解液能够很好地将皮张消化完全.

图2中10号样品采集的是林麝腹部较软的皮子，没有能提取到DNA，也没有得到扩增产物，这可能是由于皮张在熟制过程中有酸浸和刮削等工艺[8]，酸浸液会使皮肤中含有的成纤维细胞、血管内皮细胞、血细胞、淋巴细胞、毛囊及其附属腺体的细胞等细胞遭到破坏[9]，使DNA溶出，并随废液流失；对皮板刮削会使处于真皮深层的毛囊遭到破坏，使DNA进一步丢失.通过以上的试验说明，熟制标本皮张提取DNA时，不应采集腹部较软的皮子，应采集四肢、指甲缝、表皮褶皱的地方，这些地方受到的酸浸液和刮削的影响比较少，容易保留较多的DNA.

由于陈旧标本经过长期放置，核DNA 受到紫外线照射和每年定期的防虫熏蒸以及其它环境因素影响，降解的程度严重，所以在进行总DNA电泳测试时，没有得到明显条带.由图1和图2可见，虽然DNA降解很厉害，但仍然能特异性地扩增出mtDNA上的片段，这是由于mtDNA是环状DNA，比核细胞DNA难降解[10].在DNA提取过程中发现，残存于皮板中的水溶性重金属离子、鞣剂等酶抑制剂难以从体系中去除，所以标本样品用Na2HPO4溶液浸泡前处理，去除铬离子是非常重要的；并在DNA提取最后选择用DNA提取纯化试剂盒(DNA IQTM系统Promega)进行二次提取，才能有效的去除大部分的水溶性重金属离子和PCR抑制剂.

3 结 论

标本样品用Na2HPO4溶液浸泡前处理，并在DNA提取最后选择用DNA提取纯化试剂盒(DNA IQTM系统Promega)进行二次提取，才能有效的去除大部分的水溶性重金属离子和PCR抑制剂；标本林麝核DNA 受到紫外线照射和每年定期的防虫熏蒸以及其它环境因素影响，降解的程度严重，但仍然能特异性地扩增出mtDNA上的片段；熟制林麝标本皮张和新鲜肌肉都能提取到纯度较高的DNA，紫外吸收值测DNA浓度的OD值差不多，但扩增和电泳结果表明熟制林麝标本皮张DNA含量明显低于新鲜肌肉.

参考文献

[1] 陈 璐,岳 曦. 非损伤性取样研究进展[J]. 四川动物,2007,26(1):224-226.

[2] 饶 刚,李 明,牛屹东,等. 陈旧皮张中DNA提取的新方法[J]. 动物学杂志, 2001, 36 (4) : 53-57.

[3] 史 燕,吴孝兵,晏 鹏,等. 扬子鳄鞣制皮革和鳞片的DNA提取方法[J]. 动物学报, 2004, 50 (2) : 297-301.

[4] 兰 宏，王 文，施立明.鹿属动物陈旧皮张标本的DNA提取及PCR扩增[J].动物学研究，1995，16(2):146-152.

[5] 林 炜，穆畅道.与铬鞣有关的胶原化学研究进展[J].化学进展，2000，12(2):2 185-227.

[6] 贾学渊，白素英，徐艳春，张 伟. 鞣制皮张DNA的提取[J]. 东北林业大学学报，2007,35(11):66-69.

[7] Svintradze DV, Mrevlishvili GM. Fiber molecular model of collagen triple helix and DNA double helix complex in aqueous solution[J]. Asian Journal of Biochemistry, 2006, 1 (1) : 18-27.

[8] 张 伟,景松岩,徐艳春. 毛皮学[M]. 哈尔滨:东北林业大学出版社, 2002: 1-7.

[9] Donglas C Wallace. Mitochondrial DNA in aging and disease[J].Scientific American ,1997 ,(8):40-47.

[10] Ramasami T, Raghavan KV. Environment-friendly leather chemicals[J]. The LeatherManufacturer, 1993 (11) : 6-13.