乳酸菌的适酸性调节

乔磊，崔艳华，曲晓军

（1.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江省科学院 微生物研究所，哈尔滨 150010）

乳酸菌的适酸性调节

乔磊1，崔艳华1，曲晓军2

（1.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江省科学院 微生物研究所，哈尔滨 150010）

探讨了乳酸菌适酸机制有助于抗酸菌株的筛选、发酵过程中工序的优化以及培养基的优化等，进而大大提升发酵产品品质。对质子泵、产碱、细胞膜变化、大分子保护修复以及耐酸调节在内的适酸性调节机制进行了一一阐述。

乳酸菌；质子泵；适酸性；调节

0 引 言

乳酸菌是能发酵碳水化合物产生乳酸的一类革兰氏阳性细菌的总称。部分乳酸菌为人体内必不可少的具有重要生理功能的益生菌。同时乳酸菌还广泛应用于食品发酵工业。

发酵过程中由于产生乳酸，生存环境的pH值会从初始的6.6到6.8降到4.2左右[1]。另外，在人的胃肠道中产生有益作用的乳酸菌，也会面临胃液中的低pH环境。在这种低酸度的不利环境中，大多数微生物都会腐败裂解死亡。而乳酸菌却能生存，表明乳酸菌具有较强适酸能力。那么，乳酸菌是如何进行适酸性调节进而生存下来的呢？研究证明，乳酸菌耐酸性调节过程中涉及质子泵、细胞膜组成变化、DNA损伤修复、蛋白质损伤修复以及调节子调控等复杂过程。乳酸菌的耐酸性调节在不同类别的菌群中也存在差异。

1 质子泵

该途径通过去羧基反应产生ATP转运和消耗胞质内的H+，从而提高细胞质环境的pH值。此系统与细胞质环境中的酶活性有着密切的关系。

1.1 F1F0-ATP酶

F1F0-ATP酶是一多亚基分子，其既能在消耗ATP的条件下产生分子跨膜动力，也能在分子跨膜动力的推动下产生ATP。分子跨膜动力需要将细胞内细胞质中的H+排到胞外，从而使细胞内的pH值升高。F1F0-ATP酶受atp操纵子的编码调控。atp操纵子含有编码F1F0-ATP酶5个亚基（α,β,δ,γ,ε） 的所有基因。F1（α3 β3 δγε） 组分含有催化亚基， 可以催化ATP的水解。F0（a b c）组分是一个跨膜的质子通道，质子经过通道进入基质的过程与ATP的形成偶联。研究证明，在另外一条电子传递途径失活状态下，F1F0-ATP酶对于乳酸菌的生长起着至关重要的作用[2，3]。实验表明，嗜酸乳杆菌中atp（编码F1F0-ATP酶亚基）mRNA在低pH条件诱导下转录量明显增加[4]。

1.2 K+-ATP酶

阳离子转运ATP酶，例如K+-ATP酶，同样也对胞内pH的动态平衡起着重要作用。K+-ATP酶通过胞内外K+与H+的交换来调节胞内pH的平衡。例如，对于生长外界pH值为5.0的变形链球菌而言，以葡萄糖为能源的细胞在缺乏25 mmol/L的K+和有25 mmol/L的K+两种培养条件下，耐酸能力下降，仅仅可以经受5.5和6.14的pH环境[5]。

1.3 谷氨酸脱羧酶

谷氨酸脱羧酶可通过在脱羧反应中消耗H+来调节胞内pH。谷氨酸在特定运载体的协助下转运到胞内，在谷氨酸脱羧酶的催化作用下消耗H+发生脱羧反应。谷氨酸脱羧反应的产物-γ-氨基丁酸，与反向运载体结合转运出胞外[6]。由于H+消耗，胞内的pH值上升；同时，由于相比于谷氨酸酸性更弱的γ-氨基丁酸的产生，胞外pH值也略有上升。研究证明，乳酸杆菌E1亚种丙氨酸脱羧酶催化的谷氨酸脱羧反应与胞内质子的排出形成偶联[7]。

2 碱性物质的产生

乳酸菌除了通过质子泵方式消耗胞内质子外，也可以通过产生碱性物质中和胞内质子，调节胞内pH，主要包括精氨酸脱亚胺酶和脲酶途径。

2.1 精氨酸脱亚胺酶

精氨酸脱亚胺酶代谢途径是胞内pH平衡的另一有效机制[8]。这一途径由精氨酸脱亚胺酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酸激酶组成。这三个酶催化精氨酸转变成鸟氨酸、氨气和CO2的反应，并且反应过程中每消耗1 mol精氨酸形成1 mol ATP。反应产生的NH3与H+反应使环境碱化，pH值升高。同时，形成的ATP促使细胞质中的H+在F1F0-ATP酶的作用下排出胞内。实验表明，在培养基中添加47.5mM精氨酸可以保护鼠链球菌FA-1亚种在pH3.5或4.0环境中生存至少6 h[9]。

2.2 脲酶

脲酶能够催化尿素分解生成CO2和NH3（每分子尿素生成两分子NH3），从而使环境碱化。人们已经在嗜热链球菌和唾液链球菌中发现脲酶的活性。研究证明，脲酶催化的尿素分解代谢能够保护唾液链球菌长时间处在酸环境中，而不死亡[10]。

3 细胞膜变化

由于编码细胞膜合成、组装和维修的基因突变，革兰氏阳性菌对酸会很敏感[10]。研究证明，细胞膜上的脂肪酸组成变化对于细胞在pH值下降环境中生存起着关键的作用。在pH值为5的环境中成长的变形链球菌，与在pH值为7中生长的该菌相比，其细胞膜上单不饱和脂肪酸和长链脂肪酸的含量高[11]。高含量的单不饱和脂肪酸和长链脂肪酸，可以降低H+对细胞膜的渗透[1]。另外，乳酸乳球菌中参与肽聚糖合成的特定青霉素结合蛋白的失活也会导致细胞对pH的敏感性增加。这些研究充分说明，细胞膜组成变化，尤其是脂肪酸变化，对乳酸菌耐酸能力起着至关重要的影响。

此外，在酸性环境下，其他机制可能对维持细胞膜的完整性起着一定得作用。例如，在酒类酒球菌中，Lo18（小分子热休克蛋白）可能参与热或酸刺激后膜或包膜蛋白的稳定[1]。在变形链球菌中，低pH条件下，ffh基因转录上调。ffh缺陷型菌株对酸敏感，并且在低酸度刺激下不能快速加强细胞膜上F1F0-ATP酶活性，将胞内H+及时排出去[12]。

4 大分子的保护修复

对生物大分子，例如蛋白质和DNA，起着保护修复的作用的大量蛋白质，在乳酸菌的适酸机制中起着不可缺失的作用。

4.1 蛋白质损伤修复

陪伴蛋白通过蛋白质分子的折叠、变性蛋白质的复原保护以及损伤蛋白质的排出等多种方式参与乳酸菌的适酸性调节[8]。在几类乳酸菌关于适酸性调节的蛋白质组学分析研究表明，陪伴蛋白经常在低pH下高表达，可能是用来修复低酸条件下产生的损伤蛋白，或者促进蛋白质的折叠[6]。大肠杆菌中，陪伴蛋白DnaK低酸诱导产生的高表达增强了UrvA（UrvABC的必需亚基，在DNA损伤识别和核酸酶组装中起着重要作用）的稳定性[13]。这个观察表明，陪伴蛋白在适酸调节中起作用的原因之一是确保DNA损伤修复机制的正常表达。在乳酸菌中普遍存在的对适酸性调节有作用的陪伴蛋白DnaK和GroEL均属于热休克蛋白[14]。变形链球菌中的dnaK和groE操纵子以及乳酸乳球菌中的groE和clpP操纵子[15-17]的研究表明，其低pH值诱导是由其常用的热休克调控子HrcA和CtsR调节。

4.2 DNA损伤修复

胞内环境的过度酸化会导致DNA脱嘧啶和脱嘌呤。这个过程涉及碱基的质子化以及随后的碱基和戊糖之间糖苷键的断裂。碱基缺失位点处保留的残基称为脱碱基位点或者AP（apurinic,apyrimidique）位点。在乳酸乳球菌中，温和的紫外辐射可以诱导产生包括适酸机制在内的几种应激机制，同时，四种在适酸反应中高表达的蛋白质也会在DNA损伤治疗的诱导下表达。这表明乳酸菌适酸调节机制可能也包括DNA损伤修复机制[6]。变形链球菌中，耐乳酸调节机制通过酸诱导的不依赖于RecA的DNA损伤修复机制增强了对DNA损伤的抗性[18]。这进一步证实了乳酸菌适酸机制中DNA损伤修复机制的存在。

研究表明，pH值为5培养下的变形链球菌针对AP位点的核酸内切酶活性增高[19]。同时其他研究表明，变形链球菌的uvrA（uvrA是核苷酸切除修复机制的必需成分之一）缺陷型菌株在乳酸耐酸调节表现出缺陷，与野生型菌株对比，在致命pH条件下，存活率下降10倍[20]。因此，在耐酸性调节中，这两种DNA修复机制可能同时起作用。

5 耐酸机制的调节

细菌通常可以通过双组分系统感受细胞外环境的变化，并对其进行响应，进行适当的调整以适应变化的环境。研究表明，双组分系统也参与了乳酸菌的耐酸调节。在乳酸乳球菌中，几种双组分系统缺陷型表现出了与耐酸性调节相关的类型[21]。有研究表明，变形链球菌可以通过与群体感应相关的胞外信号系统来刺激其耐酸性调节。

同时其他系统也参与了乳酸菌耐酸性调节。乳酸乳球菌高亲和力磷酸运载体（pst操纵子）缺陷型菌株对酸有高耐受性[22]。低pH可以降低磷酸运载体的活性，推测磷酸调控的调控子可能在乳酸耐酸调节中起着一定作用[8]。乳酸乳球菌rcfB突变型在致死pH条件下的存活率比野生型低130倍，表明RcfB在耐酸调节中起着关键作用[22]。另外，乳酸乳球菌中涉及鸟嘌呤核苷酸代谢的基因（guaA，GMP合成酶和relA，（p）ppGpp合成酶）的失活将导致酸抗性[23]。此外，变形链球菌中的SGP蛋白（链球菌的GTP结合蛋白，变性链球菌的必需GTP酶）可能也参与了耐酸性调节过程，其功能之一就是调节GTP/GDP含量[24]。

6 展 望

如上文所述，乳酸菌存在多种适酸性调节机制，通常适酸调节都是几种机制的交叉作用。乳酸菌中存在多种参与适酸性调节的基因，其实际功能及调节特点可能会存在较大差异。要获得完整地适酸性调节机制信息，需要大量深入工作。乳酸菌全基因组的测序，毫无疑问地推动了适酸性调节相关基因的发掘和研究。乳酸菌耐酸基因以及机制的深入研究，势必为乳酸菌的深度利用和开发奠定理论基础。

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Regulation of acid adaptation in Lactic acid bacteria

QIAO Lei1,CUI Yan-hua1,QU Xiao-jun2
（1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Science Academy,Harbin 150010,China）

The understanding of acid adaptation mechanisms of LAB will benefit screening the acid-tolerance bacteria,the optimization of procedures in the ferment progress and optimization of culture.This will greatly improve the quality of fermented foods.The acid adaptation mechanisms were discussed,including proton pump,the production of alkali,the changes of membrane,protection or repair of macromolecules and the regulation of acid tolerance.

Lactic acid bacteria；proton pump；acid tolerance；regulation

Q936

B

1001-2230（2011）12-0024-03

2011-07-20

国家自然科学基金资助项目（30901048）。

乔磊（1990-），男，本科，研究方向为分子微生物学。

崔艳华