细胞培养设备的合理使用及质量控制

王成艳 韩景田 买 霞

①武警医学院教保处 天津 300162

细胞培养主要是指细胞在体外条件下的培养技术，亦即在无菌情况下，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和增殖[1]。包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术等都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。细胞培养技术在医学研究中得到了极为广泛的应用，在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。掌握细胞培养技术对临床医学各领域的学习和研究大有帮助。除洁净的室内环境外，与细胞培养技术有关的设备和器材主要有二氧化碳培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压蒸汽灭菌器、滤菌器及玻璃器皿等。结合我们的工作实践，谈谈细胞培养设备的合理使用及质量控制。

1 CO2培养箱

CO2培养箱价格昂贵，温度和气体浓度传感器灵敏，如果在使用过程中操作不当，容易导致仪器损坏，影响正常工作和仪器使用寿命。CO培养箱内的进气压要求为0.06 MPa。开门后，箱内气体散发,压力下降。关门后气体传感器在低压刺激下有节奏地开闭，向箱内充气，当进气压达到0.06 MPa时,自动停止调节。因此，在日常使用过程中，尽量避免不必要的打开培养箱，从而减少传感器的工作负荷，延长其使用寿命[2]。放置CO2培养箱的实验室室温应保持在25 ℃左右，温度过高会影响CO2培养箱的温控装置。CO2培养箱使用过程中，要求在箱内托盘中放一定量的灭菌水，使箱内为饱和湿度环境，这是针对开放培养细胞要求设计的，有利于细胞生长[3]。使用CO2培养箱培养细胞时，要每天观察二氧化碳压力表，及时更换二氧化碳钢瓶。培养箱内应放置一温度计，记录其温度与指示表温度是否一致。箱内应划分不同区域,不同细胞应放不同区域[4]。此外，CO2培养箱的箱内要经常消毒，以免细菌污染，影响细胞培养。

2 倒置显微镜

组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，用于观察培养的活细胞。倒置显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。倒置显微镜中最常用的观察方法就是相差。由于这种方法不要求染色，是观察活细胞的理想方法。应严格按照有关操作规则使用显微镜，避免因使用不当造成损毁。观察细胞时，按照先低倍后高倍的物镜选择方法，每次使用完毕后应及时做好清洁工作[5]。所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用软毛刷轻轻的掸去掉。当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3∶7）轻轻擦拭。不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。在任何情况下操作人员不能用棉团、干布块或干镜头纸擦试镜头表面，否则会刮伤镜头表面，严重损坏镜头，也不要用水擦试镜头，这样会在镜头表面残留一些水迹，而滋生霉菌，严重损坏显微镜。观察细胞生长状态时，要轻拿轻放，防止细胞被显微镜污染或损坏镜头。

3 超净工作台

超净工作台是一种局部层流装置，提供局部高洁净度环境，使工作环境无菌无尘的一种空气净化设备。为了保证超净化工作台的洁净度，使用前30 min应开启风速开关和紫外线开关，进行紫外线照射,以保证操作区有洁净空气环境，包括移液器、试管架、镊子等。超净台内也应划分不同的区域,如材料区、操作区、污物区等。注意安全,特别是酒精灯,如有酒精漏出应立即吸干擦净,以免发生意外。实验完毕,所用过的器皿、杂物必须清理,同时进行台面清洁，使工作台处于最佳状态，同时定期拆洗或更换预过滤器中的无纺布滤料。经常用酒精或丙酮等擦拭紫外线灯管，保持表面清洁，否则影响杀菌能力[6]。

4 高压蒸汽灭菌器

高压蒸汽灭菌的效果直接影响细胞培养时细胞的生长状况。灭菌不当，容易造成细菌对培养细胞的污染。灭菌器内,装放拟灭菌物品不应过挤,其总体积不应超过其容积的80%，物品装放时，上下左右均应互相间隔一定距离，以利于蒸汽与空气相互交换，,难于灭菌的大物品放上层，较易灭菌的小物品放在下层。灭菌前应对灭菌器各部位进行常规检查。灭菌时，当压力指示表升至0.35 kg/cm2时，开放排气阀，排净冷空气后再关闭，以使灭菌器内真正达到预定的温度。否则压力表上所示压力并非全部蒸汽压，灭菌将不完全。灭菌完毕后，不可突然开大排气阀门排气减压，以免因器内压力骤然下降而瓶内液体沸腾，冲出瓶外。

5 滤菌器

细胞培养时，对培养基的除菌方法通常采用滤菌器除菌，即采用滤膜滤器除菌。滤膜滤器是用金属容器将孔径不同的醋酸纤维薄膜（滤膜）夹在中间，进行过滤除菌。常用的滤膜的规格有0.22 um、0.35 um、0.45 um、0.65 um、0.8 um等几种。使用时，先将滤膜放入双蒸水中浸泡12 h以上，平铺于金属滤器上。为防止滤膜破损，通常使用双层滤膜，上层使用孔径大一点的滤膜（0.45 um），下层使用孔径小一点的滤膜（0.22 um）。固定好后，连同使用的胶管用牛皮纸包好，经高压灭菌1.04 kg/cm215 min，备用。新滤器应在流水中彻底洗涤后放在1∶100的盐酸中浸泡数小时，再用蒸馏水洗涤，干燥后保存。

6 玻璃器皿

培养用的各种玻璃器皿如玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管等均需经过清水浸泡、去污刷洗、酸浸和冲洗以及高压灭菌等程序。清洗玻璃器皿要求干净透明、无油迹，不能残留任何物质。因为某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。玻璃器皿清洗方法：新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前先用自来水简单刷洗，再用5%盐酸浸泡过夜，后用试管刷刷洗，但细胞培养瓶不能刷。将初洗的玻璃器皿放在烘箱中烘干后，放入浓硫酸重铬酸钾配制的洗液中至少过夜。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”10次以上，最后用双蒸水浸洗2～3次，烘干，包装，高压灭菌121 ℃、30 min后备用。

[1]卢圣栋.现代分子生物学实验技术(第二版)[M].北京:中国协和医科大学出版社,1999:430.

[2]赵巍,李小宁.CO2培养箱的使用,保养及故障排除[J].医疗设备信息,2006,21(6):97-98.

[3]张丽芸,卢晓,程宝鸾.二氧化碳培养箱的使用和保护[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2005,26(1):61.

[4]崔冬生,李增宁,顾平,等.细胞培养室管理规则[J].华北煤炭医学院学报,2004,6(3):395-396.

[5]韩景田,贺智,王刚.显微镜的调试使用和管理[J].中国医学装备,2009,6(1):61-62.

[6]刘金芳.净化工作台及压力灭菌器的质量控制[J].江苏预防医学,2000,11(4):65-66.