化瘀泻浊方对肾间质纤维化大鼠骨形态发生蛋白-7的影响

郭立芳 王月华 王凤丽 李林林 袁国栋

(河北医科大学中医院，河北 石家庄 050011)

肾间质纤维化(RIF)是各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰的共同途径〔1〕。其程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切。骨形态发生蛋白(BMP)-7是一种内源性肾脏保护因子，具有抗纤维化作用，而这种保护作用可能与其拮抗转化生长因子(TGF)-β1有关〔2〕。前期实验研究证明化瘀泻浊方具有减轻肾脏病理损害，减少纤维化面积，抑制肾组织 TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达的作用〔3〕。本研究以BMP-7为切入点，进一步探索本方对RIF发生发展的影响及其可能作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康、雌性SD大鼠50只，体质量(180±10)g，清洁级。由河北医科大学动物实验中心提供(动物合格证号:冀医动管字第703058号)。

1.2 主要试剂及用药 兔抗大鼠BMP-7单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。化瘀泄浊方由生黄芪30 g、生大黄 12 g、地龙 12 g、丹参 15 g、蒲公英 15 g、槐花 15 g、生牡蛎30 g、赤芍15 g等组成，由河北医科大学中医院药房提供，上药按比例称取后，水煎、过滤、浓缩，装入瓶中密封备用。缬沙坦由诺华公司提供(批号X0538)。

1.3 动物模型和分组 动物随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组，每组10只。缬沙坦组予缬沙坦5.3 mg·kg－1·d－1经口灌服;化瘀泄浊方组予化瘀泄浊方5.7 g·kg－1·d－1经口灌服;阿魏酸哌嗪分散片组予阿魏酸哌嗪分散片6.7 mg·kg－1·d－1经口灌服;假手术组和模型组予同等量生理盐水经口灌服。手术前1日开始给药至实验结束前1天。左侧输尿管结扎术按参照文献〔3〕进行。除假手术组外其余各组均行左侧输尿管结扎术。于实验第21日全部杀检，取左侧肾脏以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色进行病理学观察，并采用免疫组化方法检测BMP-7的表达。

1.4 免疫组织化学方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS-1000型全自动彩色病理图像分析系统，在200倍光镜下采集图像，每例各选15个视野，计算一个视野中阳性细胞百分数，在光亮度和放大倍数一致的条件下对免疫组化结果进行自动测量，最后取平均值。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，进行One-Way ANOVA和组间LSD法。

2 结果

2.1 HE及Masson染色结果 肾组织HE及Masson染色显示:模型组肾间质有大量炎细胞浸润和纤维组织增生，肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张，肾小球数目明显减少，面积缩小。肾小囊粘连或扩张，小囊周围大量纤维组织增生。其他各治疗组间质可见多少不等的炎细胞浸润，少量纤维组织增生，肾小管轻度扩张，部分肾小球轻度萎缩，小囊扩张，肾小球数量无明显改变。

2.2 BMP-7蛋白的表达、分布及半定量分析结果 BMP-7主要表达于集合管和肾小管胞质中，在肾小球中未发现阳性表达。半定量分析显示，在假手术组 BMP-7高表达(n=10，36.52% ±4.76%)，模型组(n=8，16.60% ±4.25%)及各治疗组较假手术组显著降低(P＜0.01);缬沙坦组(n=9，26.52% ±4.89%)、化瘀泄浊方组缬沙坦组(n=9，25.65% ±3.65%)、阿魏酸哌嗪分散片组(n=9，21.35% ±2.68%)与模型组相比，BMP-7的表达均呈显著性增高(P＜0.01)，其中化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P＜0.01)，其他各组间均无明显差异(P＞0.05)。

3 讨论

目前中医学认为，RIF病因病机有以下几个方面。先天异常:肾为先天之本，禀赋于父母之精气，若先天不足，肾精亏虚，则尿管及肾发育异常。湿热蕴结:外邪入侵，郁而化热，蕴结于肾与膀胱;或内热下移，湿热互结，膀胱气化不利，水液内停。瘀血络阻:久病多瘀，血不利则病水，瘀血阻滞，尿路不畅，水湿郁结于内;或瘀血内阻，气滞血瘀，阻塞尿路。总之，本病是以湿热、瘀血、络阻等为基本病机，且相互转化，相互影响。本实验以化瘀泄浊中药对单侧输尿管结扎诱导的RIF大鼠模型进行干预性治疗，符合上述病机，具有可行性。方中丹参、赤芍、大黄、地龙活血通络，化瘀泄浊;蒲公英、槐花清热利湿，解毒泄浊;加用生牡蛎软坚散结;生黄芪益气，且黄芪益气有走而不守之性，所以本品益气不仅可以扶正固本，又可以助丹参、地龙等行血消瘀通络祛邪治标。诸药相伍通补并用、标本兼顾，故成为临床用于延缓肾脏病发展进程的基础方。

RIF是多种慢性肾脏疾病如慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等发展到终末期肾衰的共同途径。它以过量细胞外基质在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。众多细胞因子参与该过程，TGF-β1被公认为是最主要的促纤维化因子，是各种因子诱导小管上皮-肌成纤维细胞转分化(EMT)的中心环节〔4，5〕。BMP-7 是 TGF-β 超家族中的一员，有20个以上的亚型，主要在肾、骨组织中表达，参与细胞内信号传导、调节细胞增生、分化和凋亡、调控组织发育和形态维持。在本研究中应用化瘀泄浊中药进行药物干预治疗，观察其对RIF的防治作用。发现化瘀泄浊方组大鼠肾组织BMP-7蛋白较模型组显著增高。且前期实验研究也发现化瘀泻浊方具有减少纤维化面积，抑制肾组织TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达作用〔3〕。体外研究也表明BMP-7能够拮抗TGF-β1的致肾纤维化作用，其活性减低可能会促进肾纤维化的发生〔6，7〕。BMP-7是内源性抗肾脏纤维化的调节因子，作为正调节因素的对应物，起到制约肾脏纤维化的作用，BMP-7和TGF-β1的平衡对肾脏内环境的稳定起重要作用。由此我们认为BMP-7蛋白表达减少和TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达增多与肾小管间质纤维化密切相关，但其作用机制，有待深入研究。

1 张爱青，甘卫华，陈荣华，等.胰岛素样生长因子-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成的作用〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2007;23(2):127-9.

2 Wang S，Hirschberg R.BMP-7 antagonizes TGF-beta-dependent fibrogenesis in mesangial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2003;284(5):1006-13.

3 潘利敏，王凤丽，王彦凯，等.化瘀泻浊方对肾间质纤维化实验大鼠TGF-β1、p-Smad 2/3的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2010;16(9):775-6.

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5 Roberts AB，Tian F，Byfield SD，et al.Smad3 is key to TGF-beta-mediated epithelial-to-mesenchymal transition，fibrosis，tumor suppression and metastasis〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2006;17(1-2):19-27.

6 Zeisberg M，Kalluri R.Reversal of experimental renal fibrosis by BMP-7 provides insights into novel therapeutic strategies for chronic kidney disease〔J〕.Pediatr Nephrol，2008;23(9):1395-8.

7 Motazed R.BMP-7 and proximal tubule epithelial cells:activation of multiple signaling pathways reveals a novel anti-fibrotic mechanism〔J〕.Pharm Res，2008;25(10):2240-6.