补气类中药抗神经细胞缺血/缺氧性凋亡作用的研究进展

姚于飞， 高幼奇， 胡国柱

(1.南昌大学医学院，江西南昌， 330006;2.江西省人民医院神经内科，江西 南昌 330006)

脑中风引起中枢神经系统损伤都具有神经细胞缺血/缺氧的病理发展过程，其神经细胞死亡许多属于细胞凋亡。故细胞凋亡调节的干预具有极大的治疗潜力，其将可能成为脑中风以及血管性老年痴呆的预防和治疗的新途径。因此本文就细胞凋亡与脑缺血/缺氧的关系及机制，以及补气类中药对凋亡影响的研究现状进行综述。

1 细胞凋亡的生物学特征

凋亡细胞不但存在形态改变［1］，而且具有细胞生化及基因表达变化。细胞凋亡主要有三条途径:①外源性途径:Fas/FasL、TNFRI/TNF－α、DR3/Apo3L、DR4/Apo2L 及 DR5/Apo2L等配体与受体结合后激活caspases家族蛋白并引发级联反应，诱导细胞凋亡［2－5］。②内源性途径:生长因子、激素、细胞因子缺乏，以及自由基、缺氧、照射、病毒感染等非受体介导的凋亡刺激，其引起BH3－only蛋白家族(BAD、BIK、BID、HRK、BIM、BMF、NOXA、PUMA)活化，导致线粒体外膜通透性转换孔开放、膜电位下降，促使cyt c、DIABLO、丝氨酸蛋白酶 Omi、凋亡诱导因子(apoptosis－inducing factor，AIF)、内切酶G、caspase活化的 DNA酶(caspase activated DNAse，CAD)等释放，最终诱导细胞凋亡［6－7］。③穿孔素－颗粒酶 B途径:颗粒酶B进入细胞后直接裂解天门冬氨酸残基活化caspases 蛋白［8－10］。

2 补气类中药对缺血/缺氧后神经细胞凋亡的影响

早在1993年Linnik M.D等人［11］结扎大鼠右颈总动脉并栓塞右大脑中动脉造成大脑局部缺血24 h后，从缺血区域大脑皮层细胞提取的DNA经凝胶电泳后显示出凋亡特征性梯状条带。急性缺氧和慢性间断缺氧大鼠模型证明缺氧可诱导迟发性神经细胞凋亡［12－13］。大鼠大脑皮层神经元经缺氧复氧培养也证明缺血/缺氧能诱发神经细胞凋亡［14－17］。脑缺血和出血均有缺血/缺氧的病理过程，而脑中风的疗效中西医结合均较单纯西医好，中医药对脑中风的治疗补气中药不可缺少。

2.1 抗氧自由基损伤

脑缺血/缺氧条件下中枢神经系统产生大量的自由基，导致神经细胞凋亡［18］。D－半乳糖造模的衰老小鼠给予大枣水煎剂灌胃6周后脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性显著提高，丙二醛(MDA)显著下降［19］。腹腔注射山药多糖40 d后脑B型单胺氧化酶(MAO－B)活性显著下降，GSH－PX活性、SOD 活性、脑 Na+/K+－ATP 酶活性显著提高［20］。人参总皂苷、白术多糖、黄精多糖、甘草酸二铵(DG)或甘草总黄酮治疗大脑中动脉栓塞(MCAO)模型大鼠，其脑组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、MDA含量降低，SOD活性升高，脑组织病理损伤减轻，细胞凋亡减少［21－26］。

2.2 抑制细胞内Ca2+的超载

连二亚硫酸钠无糖培养基培养胚鼠大脑皮质神经细胞模拟缺氧/缺糖证明，党参皂苷L1显著降低神经细胞的凋亡率，细胞内Ca2+平均荧光值与模型组(47.37±9.68)比较，0.1～0.01 mg/L党参皂苷L1(27.34±8.57～36.55±14.23)能显著降低细胞内Ca2+［27］。采用激光共聚焦扫描检测缺氧培养的胚大鼠海马神经元内游离钙发现，缺氧组荧光增强度为(73.5±10.31)%，缺氧 +无钙组为(4.5±2.58)%，缺氧+不同浓度人参皂甙Rb1(GSRb1)组(20、40、60、80 μmol/L)分别为(20.2 ±3.41)%、(13.6 ±2.98)%、(10.5±3.62)%和(12.7±4.51)%(均P＜0.01)，证明缺血缺氧时神经细胞内游离钙的上升主要是来自细胞外钙离子内流，GSRb1可通过抑制细胞外钙离子内流减轻细胞内的钙超载，保护缺血神经元［28］。人参二醇皂苷(PDS)(1.5 g/L)抑制缺氧大鼠大脑皮层神经元缺氧1 h时的L－型钙通道活性，L－型钙通道的开放时间由缺氧前(9.1±1.0)ms降低至缺氧后(2.1±0.4)ms(P＜0.01)，开放概率由缺氧前的(0.165±0.025)减少至缺氧后的(0.021±0.009)(P＜0.01)，证明PDS可抑制缺氧诱导的钙通道的开放并减少钙离子的内流［29］。黄芪多糖以1.0 g/kg于MCAO模型制作前30 min和制作后8 h分两次腹腔注射，大鼠缺血1 h再灌注24 h后脑组织中Ca2+、谷氨酸、天门冬氨酸等含量显著低于单纯模型组(P＜0.05～P＜0.01)［30］。三七总皂苷降低缺氧/缺糖培养的大鼠海马神经细胞内的钙离子浓度，抑制神经细胞凋亡［31］。

2.3 对凋亡相关基因表达的调控

人参皂苷Rg125～100 mg/kg灌胃7 d后制备MCAO模型缺血2 h再灌注22 h发现，人参皂苷Rg1(50～100 mg/kg)显著地减少缺血侧脑组织 Caspase－3 和增加 Bcl－2表达［32］。而腹腔注射10～40 mg/kg给MCAO模型大鼠，2 h～24 h后脑组织 Bcl－2 增高，Bax 降低，Bcl－2/Bax 比值显著上调;缺血大鼠海马CA1区Fas阳性细胞数(15.20±3.16～9.20±3.49)显著低于单纯模型组(26.00±5.64)，Fas－L表达阳性细胞数(13.40±3.03～8.20±3.01)也低于单纯模型组(21.20±4.71)，Caspase－3 表达阳性细胞(12.30 ±2.91、7.30±3.56)均低于单纯模型组(17.40±3.20)，脑组织cjun N－末端激酶(pJNK)的阳性表达率(23.89±6.77)～(9.15 ±4.77)低于单纯模型组(27.15 ± 8.46)［33－35］。即使在MCAO模型大鼠缺血再灌注后腹腔注射人参皂苷Rb1(40 mg/kg)，也可见再灌注12 h～10 d内神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)阳性细胞数显著高于缺血组，Bcl－2阳性细胞数上升，Bax阳性细胞下降［36］。大鼠全脑缺血模型制备前3 d给人参皂苷Rb130 mg/kg并持续至缺血后3d，结果发现与单纯缺血组比较CA1、DG及皮层神经元内的bcl－2表达显著增加，而bax表达显著减少［37］。体外新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧培养也证明人参皂苷Rb1在50～100 mg/L的浓度范围内通过增加缺氧神经细胞Bcl－2，减少Bax的表达，提高Bcl－2/Bax比值达到抑制神经细胞缺氧性凋亡的作用［15］。

大鼠口服西洋参茎叶皂苷7 d后制作成MCAO模型，结果西洋参茎叶皂苷(50、100 mg/kg)各组TUNEL阳性细胞显著少于缺血模型组，caspase－3 mRNA表达及 caspase－3阳性细胞数均显著低于缺血模型组［38］。

腹腔注射黄芪注射液4.5 g/kg 30 min后制作MCAO模型缺血2 h再灌注6 h后发现，与模型组相比脑组织Bax阳性细胞减少，而 Bc1－2阳性细胞增加(P＜0.05)［39］。大鼠MCAO模型制作前12 h和30 min腹腔给予黄芪注射液，脑缺血3 h后每12 h注射一次，结果再灌注12 h、24 h、48 h后各时间点caspase－8阳性细胞显著低于模型组［40］。黄芪煎剂(6 g/kg/d)灌胃1次，共7 d，然后制作大鼠MCAO模型，脑缺血2 h再灌注6 h后脑组织Fas－L阳性细胞较模型组显著降低［41］。大鼠MCAO模型缺血2 h再灌注24 h前1 h腹腔注射黄芪注射液200 mg/kg，再灌注24 h后黄芪组大鼠缺血侧皮层c－fos阳性细胞显著少于模型组［42］。缺氧缺糖0.5 h复氧复糖培养原代大鼠海马神经细胞0～120 h，黄芪注射液(0.5 g/L生药)于缺氧缺糖时加入，其各个时间点c－Jun氨基末端激酶3(JNK3)在mRNA、蛋白水平，以及JNK3活性水平上均显著低于单纯缺氧缺糖组，并抑制了神经元凋亡［43］。黄芪注射液(黄芪10、50、100 g/L 组)能显著降低缺氧培养诱导的神经细胞凋亡率，增加了缺氧的神经细胞Bcl－2 的表达，减少了 Bax 的表达，提高了 Bcl－2/Bax 比值［14，44］。

MCAO制作前10 min舌下静脉给予甘草酸二铵(DG)注射液20 mg/kg，缺血2 h再灌注24 h后梗死侧脑组织中，DG组Bcl－2表达显著高于缺血组［23］。DG对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后NF－κB p65和Caspase－3的表达明显低于对照组，TUNEL 及检测也证明抑制了神经元凋亡［45，46］。

3 展望

尽管缺血后不同基因的变化对细胞凋亡的调控及影响的确切机制尚不清楚，但理解细胞凋亡在缺血性神经细胞死亡中的作用具有重要的临床意义。抗细胞凋亡将可能成为脑中风神经细胞损伤的治疗有效手段。根据中医理论，同一药性中药功效相同或相近。事实上人参、黄芪、党参［27］、黄精、甘草、西洋参、太子参［47－48］、白术［49］、大枣［50］、山药［51］等补气类中药都具有抗多种原因引起的细胞凋亡作用。根据现有补气类中药抗神经细胞凋亡研究结果，我们有理由推测所有补气中药均有抗神经细胞缺血缺氧性凋亡的作用。

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