猪瘟诊断的研究进展

魏 娟 孙保权 卜子俊

（1.江苏省南京市六合区动物卫生监督所，南京 211500；

2.江苏省南京市六合区第二畜牧兽医站，南京 211500）

猪瘟（CSF）是的一种高度接触性传染病，由猪瘟病毒引起，以高热稽留、出血和高死亡率为主要特征。呈以多发性出血为特征的败血症病变。慢性经过的病例，主要是纤维素性坏死性肠炎，常伴有副伤寒及巴氏杆菌病继发感染。由于广泛使用猪瘟疫苗，近几年来猪瘟发病呈非典型性发病。

目前，由于诸多原因致使CSF是成为严重威胁养猪业的疾病。虽然我国早就研制出很成熟的猪瘟兔化弱毒疫苗，但由于猪瘟的流行特征发生变化，发生免疫抑制和免疫失败，感染猪瘟后也不出现明显症状，但持续排毒，必须利用各种诊断技术对猪瘟的抗原变异性进行检测。

2 病原体

猪瘟为单股正链RNA病毒。在病毒分类上属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）。基因组长12.3 KB，病毒子直径40～50 nm，病毒囊膜有55和46KD两种糖蛋白，核衣壳则为36KD蛋白质构成。猪瘟病毒与同属的牛病毒性腹泻病毒之间，基因组序列有高度同源性，抗原关系密切，存在交叉反应。

3 诊断方法

3.1 实验室常规诊断技术

3.1.1 免疫荧光试验（FAT） 用荧光物质标记提纯后的猪瘟病毒抗体IgG，再去着染猪病料（如病猪扁桃体、淋巴结、肾等）的冰冻切片或触片，再在荧光显微镜下观察组织细胞内是否有亮绿色荧光。如果被观察的组织细胞内有亮绿色荧光，就说明被检病料中有猪瘟病毒感染。否则，就是猪瘟阴性。

免疫荧光试验结果直观、可靠，是目前国内外最常用的方法，它是Robertso于1965 年首次报道的。主要检测病猪扁桃体、淋巴结、肾脏、脾脏等组织中的猪瘟病毒，在猪瘟病毒感染早期检出率较高，还能检出无明显症状的带毒母猪，并且可在12 小时内判断结果，既快速又准确，所以常用于病程初期诊断、检疫及猪场进行猪瘟净化。

3.1.2 血清学检测方法 酶联免疫吸附试验（ELISA）是世界动物卫生组织推荐的猪瘟检测方法。可采用间接ELISA和夹心ELISA法进行检测，主要用于检测血清抗体和组织中病毒，其中，间接ELISA主要用于鉴别感染时会受免疫的干扰，而夹心ELISA则用于猪瘟病毒的初步定型，检测猪脾脏、肠系膜淋巴结、肺脏等组织中的病毒，能检测出是否为猪瘟强毒感染，具有高度特异性和敏感性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害。

3.2 分子生物学检测技术

3.2.1 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 在猪瘟诊断中针对的对象是病毒的核酸，根据猪瘟病毒基因特定的序列，合成一对特异性引物，在引物的介导和反转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下（254 nm）可见到特异扩增区带。该方法适用于各种含毒病料的检测，可用于临床诊断，其操作简单，并且特异性强、灵敏度高、重复性好，可快速检测。

3.2.2 反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR) 使用2对聚合酶链式反应引物扩增完整的片段。对组织材料、细胞或肉汤培养物中含量低的猪瘟病毒进行二次扩增，该方法能将我国流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来，且不与其他猪源病毒和牛病毒性腹泻病病毒发生非特异反应。可以较快对猪瘟做出准确诊断，并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来，减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。

3.3.3 多重PCR(multiplex PCR)[2]指应用多对引物同时扩增一个基因中的几个不同DNA片段，或不同基因的几个DNA片段。多重PCR中所设计的多对引物对必须有非常接近的退火温度，如果2对引物间的Tm值相差悬殊，可引起扩增产物量的差别，常出现其中一个引物对无明显的扩增产物。此外，靶基因DNA的扩增长度也必须相类似，否则较短的靶基因DNA的扩增效率明显优于扩增片段较长的DNA。因此，为了取得相同的扩增效率，必须调节各引物对之间的Tm值和PCR扩增产物的长度以及各引物对的量。该方法具有高效、经济简便等特点，能够快速、准确的诊断疾病，适合大量临床样品中病原体的快速诊断。

3.3.4 环介导等温扩增技术 日本学者Notomi 博士于2000 年建立了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification ， LAMP)[3]，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 ℃左右) 保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP 是一种崭新的DNA 扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，具有替代PCR 方法的可能性。

3.3 基因芯片检测技术

基因芯片（又称DNA芯片）是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，其原型是20世纪80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片技术为猪瘟诊断技术提供了新的技术理念，目前已经正进行这方面的研究，其研究成果将对我国猪瘟的防控具有深远意义。

[1] 李艳，仇华吉，王秀荣，等.鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法的建立[J]. 中国农业科学， 2006， 39 (9): 1907-1914.

[2] 谢玉洁. PRRS、PCVD和CSF 病毒多重PCR方法的建立及其应用研究[D]. 合肥: 安徽农业大学， 2008