诱导性多潜能干细胞的研究进展与应用

蒋兴然，陆士新

中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院＆肿瘤研究所国家分子肿瘤学重点实验室，北京 100021

诱导性多潜能干细胞的研究进展与应用

蒋兴然，陆士新

中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院＆肿瘤研究所国家分子肿瘤学重点实验室，北京 100021

分化成熟的体细胞可在体外被重编程为诱导性多潜能干细胞，后者具有与胚胎干细胞相似的自我更新能力和发育多潜能性，同时避免了免疫排斥和伦理问题。患者特异性的诱导性多潜能干细胞将成为再生医学、药物筛选和毒理测试的理想工具。

诱导性多潜能干细胞;体细胞重编程;发育多潜能性;分化

诱导性多潜能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPSCs)是通过将特定的重编程因子导入体细胞从而产生一种具有与胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESCs)相似特征的细胞。由于ESCs在伦理和法律等方面受到限制，干细胞研究曾一度陷入危机，而此时不涉及人类胚胎的iPSCs的出现为干细胞研究领域注入了强大生机与活力，成为了ESCs最理想的替代者。iPSCs是当前国际上的热门研究领域，尽管在其诱导效率和安全性方面仍存在问题，但相信随着更多深入研究的进行，iPSCs将拥有更广阔的应用前景。

iPSCs的研究进展

iPSCs的产生 iPSCs的产生与体细胞重编程现象密不可分。在体细胞核移植、细胞融合等特定条件下，高度分化的体细胞关闭了体细胞特异性表达的基因，开启了使细胞具有自我更新能力和发育多潜能性的基因，从而被重编程为具有ESCs特性的一类细胞。

2006年，日本Takahashi等［1］率先发现将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4个基因通过逆转录病毒介导转入胎鼠成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblast，MEF)或成年小鼠尾部成纤维细胞，可以诱导这些细胞发生重编程，获得了细胞形态和分子遗传特点与ESCs极其相似的新细胞，即iPSCs。

继成功建立小鼠 iPSCs后，2007年，Takahashi等［2］和 Yu等［3］又分别将人的体细胞重编程为 iPSCs，使iPSCs的研究向前迈进了重要一步。Takahashi等［2］利用此前在小鼠中建立的逆转录病毒系统，将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种基因导入成人的成纤维细胞，使其成功转变为iPSCs。与此同时，Yu等［3］则独自确定了14种候选基因，经过筛选，使用慢病毒介导表达Oct4、Sox2、Nanog和Lin28 4个因子，成功地将新生儿的成纤维细胞转变为iPSCs。

Park等［4］采用与 Takahashi等［2］相同的 4 种基因以及hTERT和SV40大T抗原基因，成功地将直接从志愿者身上提取的皮肤细胞重编程为iPSCs，意味着从任何健康人身上提取皮肤细胞产生iPSCs是可行的。

此外，多个研究小组分别在大鼠、猴和猪等物种中建立了诱导性多潜能干细胞系［5-9］。这些研究成果说明iPSCs的诱导技术应用范围较广，可相对便利地在多物种中建立多潜能性细胞的细胞系，有助于建立人类疾病的多种动物模型，为今后应用iPSCs治疗人类疾病的安全性和有效性提供了充分的动物实验数据。

iPSCs诱导技术的优化 Takahashi等［2］和 Yu等［3］早期采用的四因子诱导方法产生 iPSCs的效率很低并含有潜在致癌因子 Klf4［10］和 c-Myc［11］，以及病毒载体可能引发的插入突变等，使得iPSCs在安全性上存在很大问题。近年来，各国的研究小组主要从以下几个方面进行了改进。

减少致癌因子使用，提高诱导效率:Nakagawa等［12］和 Wernig等［13］只用 Oct4、Sox2 和 Klf4 3 个因子成功诱导出iPSCs，降低了其成瘤性。Marson等［14］发现在培养基中加入可溶性Wnt3a后，可提高诱导产生iPSCs的效率。Feng等［15］则发现采用 Essrb、Oct4和Sox2 3个因子可成功诱导出小鼠的iPSCs。Esteban等［16］通过在培养基中添加维生素C，减轻了细胞衰老，使iPSCs诱导效率提高约 10倍。Lin等［17］将miR-302导入人黑素瘤细胞和前列腺癌细胞，将肿瘤细胞重编程为具有多潜能性的iPSCs。Judson等［18］则发现 miR-291-3p、miR-294和 miR-295可提高 Oct4、Sox2和Klf4 3个因子的重编程效率。Kim等［19-20］只用1个因子Oct4，即可使人胎儿神经干细胞和小鼠神经干细胞重编程为iPSCs。最近，他们还发现染色体重塑复合物BAF通过影响多能性基因的表达而在重编程中发挥重要作用，在重编程过程中过表达Brg1和Baf155可以显著提高体细胞转化为iPSCs的效率［21］。

避免病毒导致的基因组DNA不稳定:病毒可将外源基因整合入基因组DNA中，从而引发插入突变，产生致癌作用。因此，应当减少和尽量避免病毒载体的使用。Kaji等［22］和 Woltjen 等［23］以病毒的2A肽序列生成结合 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子的多顺反子载体，利用piggyBac转座子将其送入细胞中，将人和小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs，随后通过顺时表达转座酶即可将外源因子从基因组DNA中除去。Yu等［24］利用非整合的附着体载体，将诱导因子导入人成纤维细胞使其重编程为iPSCs，停止药物筛选后可进一步分离出丢失这些附着体载体即不含转基因序列的人iPSCs。另一种方法是利用由细胞穿膜肽与重编程因子融合表达形成的重组蛋白质直接穿透细胞膜进入细胞内部，发挥重编程作用产生人和小鼠的iPSCs［25-26］。这种方法没有使用病毒或其他载体导入外源DNA，从而避免了外源基因插入可能导致的基因组DNA不稳定，使iPSCs更加安全可靠。

体细胞种类的选择:不同的体细胞类型对iPSCs的产生效率和安全性有重要影响。Aoi等［27］发现由小鼠肝脏细胞和胃表皮细胞获得的iPSCs比由胎鼠成纤维细胞获得的iPSCs成瘤性要低。Aasen等［28］则发现以人角质形成细胞为供体细胞，同样用逆转录病毒来介导表达 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc，可使约1%的角质形成细胞重编程获得iPSCs，效率比用成纤维细胞作为供体细胞至少高100倍，并且诱导过程只需10 d，而使用其他供体细胞则需要数周。Li等［29］发现用同样的诱导方法，使用孕妇产前诊断的羊水细胞可以更高效、快速地产生iPSCs，效率最高可达到1.525%，且使重编程时间缩短至6d。Sun等［30］发现人脂肪干细胞与皮肤成纤维细胞相比，更容易被诱导为iPSCs，效率是后者的20倍。脂肪干细胞内Klf4、Klf2、Esrrb和c-Myc基因的表达水平明显高于皮肤成纤维细胞可能是其更易于被诱导为iPSCs的原因。最近，3个研究小组同时分别从人外周血中分离单核细胞或T细胞，并将其诱导成为iPSCs，从血样采集到获得iPSCs的全过程在1个月内即可完成，使得从临床上获得患者特异性的iPSCs变得更加便捷［31-33］。其中，日本 Seki等［32］利用温度敏感型的仙台病毒突变株将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc导入T细胞中，避免了外源基因整合入基因组，使获得的iPSCs更加安全。相信随着多种体细胞被成功重编程为iPSCs，以及对重编程机制的进一步研究，将有望找到兼具高效、安全、易于取材等优点的供体细胞。此外，Yoshida等［34］发现在重编程iPSCs的过程中，如果将培养环境氧浓度降低至5%，可有效提高iPSCs的诱导效率。综上，为了更高效地获得安全的iPSCs，可采取以下几种方法:(1)根据不同的研究或治疗目的选用适当的供体细胞;(2)减少外源基因的数量和病毒等载体的使用，避免遗传修饰;(3)加入小分子化合物和维生素C等，提高iPSCs的诱导效率;(4)在诱导过程中选择适当的培养环境如低氧浓度。

iPSCs的多潜能性鉴定 Takahashi等［1］最初获得的iPSCs克隆在形态和多潜能特征标记基因的表达上与ESCs克隆相似，在体外培养可形成拟胚体，具有形成畸胎瘤的能力，进行囊胚注射可形成嵌合体小鼠胚胎，但在全基因表达谱与多潜能转录因子DNA甲基化谱方面与ESCs还存在较大的差异，不能形成成年嵌合体小鼠且没有生殖系转移能力。

经过3个独立研究小组的研究改进，采用在ESCs的自我更新和多潜能性的维持中起关键作用的Oct4或Nanog基因作为激活系统进行筛选时，获得了真正的iPSCs，其全基因表达谱、DNA甲基化谱、组蛋白H3甲基化修饰以及X染色体的表观遗传状态与ESCs几乎一致，可以形成二倍体嵌合成年小鼠并传递至生殖系细胞中，并且通过该二倍体嵌合小鼠的繁殖得到了后代小鼠［35-37］。Meissner等［38］尝试将iPSCs注射到小鼠四倍体囊胚 (仅提供营养环境，无发育能力)中，获得了14.5 d的活胚胎。Zhao等［39］和 Kang等［40］分别将 iPSCs注射入小鼠四倍体囊胚，再移植入代孕母鼠体内，发育得到了完全来源于iPSCs的可以存活并具有繁殖能力的后代——用四倍体胚胎补偿这一严格标准进一步证明了iPSCs的多潜能性。

最近，Liu等［41］和 Stadtfeld等［42］通过比较具有不同发育潜能的小鼠诱导性多潜能干细胞系和胚胎干细胞系的转录谱，发现了可以用来评估小鼠干细胞多能性水平和小鼠iPSCs重编程完全性的基因组保守区Dlk1-Dio3，该区域在小鼠胚胎干细胞和可以产生四倍体胚胎补偿小鼠的iPSCs中为激活状态，而在不完全重编程的仅具有部分多能性的iPSCs中被异常沉默。该区域内的基因簇和microRNA簇的激活程度与细胞的多能性水平呈正相关，并且在小鼠基因组中没有发现其他具有此类特性的区域，因此可作为评估小鼠干细胞和iPSCs多能性水平的分子标记，对干细胞及iPSCs的多能性机制研究和临床应用具有重要的推进作用。

iPSCs的应用

iPSCs具有与ESCs相似的自我更新能力和发育多潜能性，且供体细胞的取材简单易行，避免了ESCs所涉及的伦理问题和免疫排斥问题。利用iPSCs诱导技术可以将患者体细胞重编程成为患者特异性iPSCs，作为疾病的细胞模型来开展发病机制、药物筛选、毒理等一系列研究工作。患者特异性iPSCs也可被人工诱导分化成多种体细胞类型，在细胞治疗和再生医学领域拥有广泛、良好的应用前景。

Hanna等［43］首次应用iPSCs进行了治疗性研究。他们采用人源化镰刀形红细胞贫血症小鼠动物模型，取得其尾尖部皮肤的成纤维细胞后诱导产生个体化的iPSCs，通过同源重组方式将人野生型βA-珠蛋白基因替代了βS-珠蛋白基因，将该基因型正常的iPSCs在体外定向分化为造血祖细胞，移植入经照射处理的患病小鼠体内后可治疗其镰刀形红细胞贫血症。Raya等［44］从Fanconi贫血症患者身上取得皮肤成纤维细胞，利用病毒将缺陷基因导入该细胞，随后经重编程作用获得了遗传修饰后的Fanconi贫血症患者特异性iPSCs。这些iPSCs能够分化形成表型正常的髓系和红细胞系的造血祖细胞，但由于整个过程中使用了病毒载体，安全性不能保证，所以尚未应用于临床治疗。Nishimura等［45］将小鼠iPSCs定向培育出听神经祖细胞，随后将其移植入新生幼鼠的内耳耳蜗，1个月后移植入的多数细胞不断发育成熟构成了螺旋神经节。螺旋神经节的减少或消失会导致听力障碍，因此该成果为用iPSCs治疗因听神经数量减少导致的听力障碍奠定了基础。最近，Tsuji等［46］将多株iPSCs诱导分化成的神经球移植入NOD/SCID小鼠脑部进行成瘤性检测，筛选出安全的iPSCs，并将由这种安全的iPSCs诱导分化出的神经球植入脊髓受损的小鼠体内，促进了小鼠运动功能的恢复且没有导致肿瘤的发生。采用这种预先的安全性评估和筛选方法，为解决iPSCs在临床应用上的安全问题提供了新的思路。这些研究成果均展现了iPSCs在临床治疗上潜在的巨大应用价值。

多个研究小组分别建立了多种患者特异性的诱导性多潜能干细胞系用于研究，如肌肉萎缩症、亨廷顿病、唐氏综合症、1型糖尿病、帕金森氏病等［47-50］。其中，Dimos等［47］从罹患家族型肌萎缩性脊髓侧索硬化症这种神经退行性疾病的老年人皮肤成纤维细胞中诱导出了患者特异性的iPSCs，并成功地将其定向分化成为运动神经元，该成果提供了可靠的疾病体外细胞模型，可用于研究发病机制或筛选阻止神经元退行药物，还可以通过遗传修饰纠正相关基因得到正常的运动神经元用于细胞替代治疗。Ebert等［48］则建立了脊髓性肌萎缩患者特异性iPSCs，并将其定向分化为运动神经元，随着时间推移成功观测到了这些神经细胞出现的异常变化直到2个月后因疾病死亡。由于患者特异性iPSCs可以不断地提供这种运动神经元，使得研究者可以在体外反复再现疾病发生发展直至死亡的全过程，在研究疾病的分子机制和研发新药等方面有重大意义。

问题与展望

提高iPSCs的诱导效率和安全性以使其应用于临床医疗是当前研究的热点，各种改进方法层出不穷，未来甚至将有可能出现只须使用1种重组蛋白或是某些小分子化合物即可将体细胞转变为iPSCs的方法。只有对这些方法从安全和效率等方面进行系统全面的比较和评估，才能挑选出获得高质量iPSCs的最佳方法。

Vierbuchen等［51］从iPSCs的重编程方法中受到启发，筛选出3个神经系统特异的转录因子，绕过了iPSCs，直接将小鼠成纤维细胞重编程为功能性神经元。尽管这种绕过iPSCs的方法受限于需要从人体上大量获取重编程所需的供体细胞，但这一有趣的研究成果仍旧为从体细胞直接培育各种组织细胞提供了新的思路。

同时，应该注意到关于iPSCs还有一些主要问题依然没有得到很好的解答，如诱导体细胞重编程产生iPSCs的分子机制，以及iPSCs和ESCs在表观遗传修饰和基因表达谱方面的差异与它们的发育多潜能性和致癌性有着什么样的关系等。最近，Li等［52］发现导入的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子通过抑制维持间质细胞特征的转录因子Snail以及TGF-β信号通路，并诱导E-cadherin等上皮细胞特性基因表达，抑制了成纤维细胞的上皮间质转化，转而开启了间质上皮转化，启始了成纤维细胞转变为多潜能细胞的重编程过程。该研究对于阐明iPSCs的诱导机制是一个良好的开端。此外，iPSCs在癌症研究中也将发挥出巨大作用。肿瘤细胞与多潜能细胞具有很多相似之处，都具有永生化特点，也都能成瘤。因此，iPSCs将有助于阐明永生化、癌变与重编程过程之间的重要联系。

Marchetto等［53］发现将人的神经干细胞转化为iPSCs后，这些iPSCs仍携带着供体细胞的一些转录标签。而Hu等［54］通过比较 iPSCs和 ESCs分化为神经上皮细胞和各种功能神经元的能力，发现iPSCs表现出明显的低效和更多的变异，不能忠实地重现ESCs的所有分化能力。以上结果说明需要更深入地研究重编程产生的iPSCs与ESCs的异同，并探索出更有效的方法将iPSCs分化成临床需要的细胞类型，应用于建立疾病模型、药物筛选、毒性检测、细胞替代治疗和再生医学等领域，加快从基础研究向临床应用的转化。

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Research Advances in Induced Pluripotent Stem Cells

JIANG Xing-ran，LU Shi-xin

State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Institute＆ Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100021，China

LU Shi-xin Tel/Fax:010-67712368，E-mail:shlu1212@gmail.com

Differentiated somatic cells can be directly reprogrammed into induced pluripotent stem(iPS)cells in vitro.Similarly to embryonic stem(ES)cells，iPS cells have pluripotency to differentiate into all cell types and capability to self-renew themselves indefinitely.Without immune rejection and ethical issues，patient-specific iPS cells promise to be an ideal tool for regenerative medicine，drug screening，and toxicity testing.

induced pluripotent stem cells;somatic cell reprogramming;pluripotency;differentiation Acta Acad Med Sin，2011，33(4):456-461

陆士新 电话/传真:010-67712368，电子邮件:shlu1212@gmail.com

Q813

A

1000-503X(2011)04-0456-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.04.022

国家自然科学基金 (30971448)和国家重点基础研究发展计划项目 (973计划)(2009CB521803)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30971448)and the National Basic Research Program of China(973 Program)(2009CB521803)

2010-06-02)

(本文编辑:孔朝霞)