膀胱癌受体酪氨酸激酶基因及蛋白的表达

文 进，李汉忠，纪志刚，严维刚，石冰冰

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院泌尿外科，北京100730

受体酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinases，RTKs)在浸润性膀胱尿路上皮癌发生、发展中起重要作用，是启动肿瘤细胞内造成癌进展、转移和治疗抵抗性等生物学特性的信号事件级联反应的关键。本研究采用实时定量PCR芯片和蛋白芯片，检测膀胱癌RTKs mRNA及蛋白表达，以发现有前景的生物标志物及可能的药物靶点，为将靶向药物治疗膀胱癌应用于临床提供实验依据。

材料和方法

RTKs实时定量PCR芯片检测

标本来源:实验组膀胱肿瘤组织取自手术切除的标本，直径为2 cm，术后经病理检查证实为高级别浸润性膀胱尿路上皮癌，侵犯深肌层，临床分期为T2bN0M0。对照组为经病理证实的、肿瘤旁2 cm以外正常膀胱组织。

总RNA抽提及鉴定:采用Trizol一步法抽提实验组总膀胱癌组织及对照组膀胱组织RNA，抽提的总RNA用分光光度法检测其量和纯度，测定260 nm波长的吸光度以定量，测定260 nm和280 nm波长吸光度的比值以确定纯度。

实时定量PCR:聚合酶激活/变性，95℃ 10 min;扩增40个循环，95℃ 15 s;60℃ 1 min，收集荧光。

阳性结果判断:Log2(FC)＞2或＜-2为差异表达基因。

RTKs蛋白芯片检测

选取RayBio人细胞因子抗体芯片试剂盒，X线胶片曝光后，将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为Microsoft Excel文件。

结 果

筛选出的RTKs差异表达基因TGFA、STAB1、SERPINE1、ANGPT2、 SPINK5、 ANGPTL1、 PROK1、MDK、CXCL9、GRN、RUNX1、VEGFA、TGFB1在膀胱癌组织中的表达显著上调，EDIL3、PTN、CCL2、PDGFD、FGF13、 KITLG、 FGF2、 SERPINF1、 TNF的表达显著下调 (图1)。

筛选出的RTKs差异蛋白ALK、Btk、EphB2、ErbB4、PDGFR-α、ROS、Tie-2、Tyk2、VEGFR3 蛋白在膀胱癌组织中高表达，FRK、Fyn、IGF-IR、Insulin R、Itk、JAK1、JAK3、LCK蛋白低表达 (图2)。

讨 论

膀胱癌的发病率占我国泌尿系统肿瘤的首位，是一种严重威胁患者健康的疾病。膀胱癌95%以上为尿路上皮癌，大约20%有基层浸润 (T2～T4)，5%诊断时已有远处转移［1］。浸润性膀胱尿路上皮癌早期症状较少，进展快，易复发;晚期经各种治疗，预后仍较差。近年来出现了以吉西他滨联合顺铂为基础的标准一线化疗方案，使得治疗晚期浸润性膀胱尿路上皮癌的有效率大大提高，但并不能使其预后发生质的改变。导致这一结果的主要原因是由于浸润性膀胱尿路上皮癌对化疗药物的耐药及化疗药物本身的不良反应，因此发展以膀胱癌分子生物学为基础的新治疗方法显得十分必要和紧迫［2］。

图1 膀胱癌受体酪氨酸激酶实时定量PCR扩增图Fig 1 Real-time quantitative PCR array of receptor tyrosine kinases in bladder cancer tissue

图2 膀胱癌受体酪氨酸激酶蛋白芯片的灰度TIFF格式图片点阵Fig 2 Cytokine antibody array of receptor tyrosine kinases in bladder cancer tissue

众所周知，浸润性膀胱尿路上皮癌以空间上的多中心与时间上的反复发作为特点，其发病机制仍不完全明确。分子生物学的迅猛发展使得人们能够不断从基因和蛋白水平寻找膀胱癌发病机制及肿瘤标志物。在过去的20年里，人们对于肿瘤分子发病机制的认识显著提高，发现了一系列调节浸润性膀胱尿路上皮癌发生、发展的蛋白激酶，从而促进了以抑制肿瘤蛋白激酶为目标的分子靶向治疗的发展。人们陆续发现浸润性膀胱尿路上皮癌细胞外受体、受体信号途径水平的存在潜在的干预点［3-4］。其中RTKs在膀胱尿路上皮癌发生、发展中起关键作用。RTKs被激活后发生级联反应，导致细胞周期进展、有丝分裂信号和许多其他对癌症进展很关键的事件发生，被认为是理想的抗肿瘤药物治疗靶点。

酪氨酸激酶调节是几乎所有至今发现的以RTKs为基础的广泛的信号传导途径。RTKs是膜结合的Ⅰ型糖蛋白，其结构的共同特点是整个分子可分成3个结构区，即胞外的配体结合区、细胞内部具酪氨酸激酶活性的功能区和连接这2个区域的由疏水氨基酸组成的跨膜区。配体结合RTKs胞外区域后使其构象发生变化，引起受体在胞膜上迁移、聚集，并形成寡聚化的受体配体复合物，激活胞浆的酪氨酸激酶而活化，导致自身磷酸化及下游大量胞内底物蛋白质分子的酪氨酸磷酸化，启动不同信号途径将信号逐级传递。以RTKs为基础的信号传导途径包括Ras-Raf有丝分裂原激活的蛋白激酶途径、磷酯酰肌醇-3激酶/AKt途径和核因子κB途径，因此被认为是启动肿瘤细胞内造成癌进展、转移和治疗抵抗性等生物学特性的信号事件级联反应的关键［5］。

本研究采用实时定量PCR芯片和蛋白芯片，检测出高级别浸润性膀胱癌组织中TGFA、STAB1、SERPINE1、ANGPT2、 SPINK5、 ANGPTL1、 PROK1、MDK、CXCL9、GRN、RUNX1、VEGFA、TGFB1基因显著上调，而EDIL3、PTN、CCL2、PDGFD、FGF13、KITLG、FGF2、SERPINF1、TNF基因显著下调;ALK、Btk、EphB2、ErbB4、PDGFR-α、ROS、Tie-2、Tyk2、VEGFR3蛋白在膀胱癌组织中高表达，FRK、Fyn、IGF-IR、Insulin R、Itk、JAK1、JAK3、LCK蛋白低表达。膀胱癌血管内皮生长因子/血小板衍生生长因子mRNA及蛋白表达显著增高。进一步证实RTKs家族中的众多成员直接参与了膀胱癌的发生和进展。而其中的血管内皮生长因子正是新型靶向药物甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼的作用位点，由此推测靶向RTKs药物可能在治疗膀胱癌方面发挥积极作用。进一步运用蛋白芯片及动物实验模型验证相关结果，将有助于未来将靶向药物应用于临床治疗膀胱癌。

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