自建糖化血红蛋白酶法检测系统的探讨

曾子杰 罗文英

（湖南省洞口县人民医院，湖南 邵阳 422300）

据估计，目前全球范围内的糖尿病（DM）患者达2亿，而我国约为4000万，发病率已达到2.5%～3.25%。虽然评价DM疗效的方法众多，但无论采用何种方法反映血糖的变化，最后均要以糖化血红蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）作为评价一种药物或治疗方案是否在血糖控制上有效。HbA1c可反映近2～3个月的平均血糖水平，且受患者其他条件的影响较少，而被广泛应用于DM的药物疗效观察及判断血糖控制程度[1]。目前，HbA1c的测定方法多种多样，不同的方法在测定组分和抗干扰能力等方面均存在差异[2-4]。近几年应用酶法测定糖化血红蛋白的日益增多，直接酶法操作方便，不易受其他因素干扰，具有较好的精密度和准确度，能上生化仪。我们通过自建酶法HbA1c检测系统，对其进行了一些探讨。

1 材料与方法

1.1 检测系统的组成

①仪器：HITACH7180，日本株式会社日立高新技术生产，按厂方要求进行保养和定期检修。②试剂：日本积水医疗株式会社提供，试剂盒的组成包括：a.前处理液：批号819RHH。b.试剂R1：N-（羧甲基氨羰基）-4，4／-二甲氨基二苯胺化钠，批号813REH；试剂R2：过氧化物酶，果糖基氨基酸氧化酶，批号811REH。c.校准品：NORUDTA专用校准品，低值（HbA1c4.7%），批号810RGH；高值（HbA1c10.1%），批号810RGH。d.质控品：低、高值HbA1c分别为4.8%～5.4%、8.5%～9.1%，批号807RDH。③参数设置：按厂家提供的参数手册采用三点两项目法进行两点校准，在同一个比色杯中三点读数，分别得出血红蛋白（Hb）和HbA1c的绝对值，再用公式计算得出HbA1c%。

1.2 标本来源

①正常对照组：均为排除了DM、糖耐量减退（IGT）和空腹血糖受损（IFG）的洞口县人民医院健康体检者（FBs＜6.1mmol/L），共213例，男121例，女92例，年龄（44±21）岁，平均43.2岁。②DM组：2009年8月至2010年12月武冈展辉医院住院和门诊的DM患者87例，男52例，女35例，均符合WHODM诊断标准，年龄53.5±11.5岁，平均49.1岁。

1.3 标本处理

用EDTA-K2抗凝管抽取晨间空腹静脉血2mL，立即混匀，800×g离心5min后取红细胞25μL，加500μL前处理液溶血后置室温10min，再上机测定。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 参考值调查

各实验组HbA1c测定结果经统计处理，正常对照组和DM组差异有统计学意义（t检验，P＜0.001）。正常对照组HbA1c参考范围为（4.85±0.75）%，与说明书提供的（5.05±0.75）%基本一致，DM组为（7.70±2.40）%。

2.2 重复性试验

取质控品807RDH低、高值分别进行批内和批间重复试验，次数均为20次。批间CV%分别为3.7%、3.4%，批间分别为7.5%、6.7%。

2.3 回收试验

取高值校准品用前处理液配成HbA1c为4%、6%、8%、10%的浓度，进行双份测定，其实测值分别为4.11%、5.95%、7.84%、9.77%，回收率分别为102.8%、99.2%、98.0%、97.7%。

2.4 线性试验

取经双份重复测定HbA1c均值为16.2%的无溶血标本配成HbA1c实际浓度为2%、3%、4%、8%、12%、16%的溶血液，进行双份测定，其实测值分别为2.51%、3.27%、4.15%、7.74%、12.36%、17.12%，回收率分别为125.5%、109.0%、103.8%、96.8%、103.0%、107.0%，线性范围与说明书提供的3%～16%基本相符。

3 讨 论

近年来国内临床检验主管部门提倡重视HbA1c的测定技术及量值溯源[5]，以高效液相色谱（HPLC）法作为检测糖化血红蛋白的金标准，但HPLC法的实验要求高，操作复杂，难以在基层普及，且存在检测特异性问题。当前，HbA1c测定的各种方法中，最适合基层医院的只有免疫法和酶法，这两种方法的原理不同，准确度、精密度也有差异。免疫比浊法本身就有诸多不足之处，抗干扰能力也不强[6]。而且各厂家产品的单抗针对的抗原决定簇不同，亲和力有差异，变异血红蛋白的影响也不容忽视[7]。而酶法测定游离胆红素、结合胆红素＜50mg/dL，维生素C＜50mg/dL，乙醛化、乙酰化、羰基化等修饰血红蛋白对测定结果均无影响。国内生产酶法HbA1c试剂的厂家也不少，但大多不能在一个比色杯中完成Hb和HbA1c的同步测定。还有些厂家的试剂不测定Hb而只测HbA1c，以标准Hb折算出HbA1c%，由于个体差异和疾病的影响，有时会引入较大的误差。

检测系统是指完成一个检验项目所涉及的仪器、试剂、校准品、检验程序、保养计划等的组合。国际上特别强调使用固定组合的检测系统，使结果具有溯源性和可比性，但国内实验室尤其是基层仍在大量使用血建检测系统。我们建立的HbA1c酶法检测系统，操作简便、通用性强、成本低廉、结果可靠，可溯源到日本的国家参考体系，在目前不失为一种可供基层选择的好方法。而且，我们通过规范化的实内质控，达到了较好的精密度和准确度。

2002年国际糖尿病协会（IDF）、欧洲糖尿病学会（EASD）、美国糖尿病学会（ADA）和IFCC达成共识，认为目前应采用IFCC参考方法作为新的全球标准为HbA1c生产厂商定值[8]。这样，只要我们保持检测系统的稳定，做好校准和质控，基本能保证结果的溯源性。我们相信，随着HbA1c全球标准化的稳步推进，酶法检测HbA1c会得到更广泛的临床应用。

[1] 薛声能,程桦.糖化血红蛋白的研究进展[J].国际内科学杂志,2008,35(10):586.

[2] 周新,府伟灵.临床生物化学与检验[M].4版.北京:人民卫生出版社,2008:50-51.

[3] 叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:347-351.

[4] 周佳烨,吴炯.糖化血红蛋白测定在DM诊断和治疗中的应用[J].检验医学,2008,25(8):583-587.

[5] 王冬环,张传宝,陈文祥,等.应重视糖化血红蛋白测定技术及量值溯源[J].中华检验医学杂志,2008,31(9):965-968.

[6] 马中伟.免疫比浊反应中标准曲线的线性拟合[J].实用医技杂志,2004,11(10):1959.

[7] Roberts WL,Safar-Pour S,De Bk,et al.Effects of hemoglobin C and S traits on glycohemoglobin measurements by eleven methods[J].Clin Chem,2005,51(4):776-778.

[8] Report of the ADA/EASD/IDF Working Group of the HbA1c Assay,London,UK,January 2004[J].Diabetologia,2004,47(1):53-54.