恶性疟原虫多药抗性蛋白pfMRP1研究新进展*

徐淑慧(综述),杨照青

近几年在疟疾的治疗中,抗疟药抗药性的产生成为疟疾控制的最大难题,随着分子生物学技术的发展,从分子水平上研究恶性疟原虫的抗药性的产生取得了重大突破性进展,恶性疟原虫多药抗性蛋白pfMRP1(The P.falciparum M ultid rug Resistance Protein 1)被认为是和多种药物抗性产生有关的ABC转运蛋白,与抗疟药抗性的产生有密切关系。

1 恶性疟原虫多药抗性蛋白pfMRP1与ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC蛋白)

在疟疾的治疗中,疟原虫尤其恶性疟原虫抗药性的产生,严重影响了疟疾的有效控制,疟原虫抗药性产生的潜在机制是复杂多因的,导致抗药性产生的最重要的因素是药物到达不了它的靶点,这归因于疟原虫基因组中有一种活性物质转运蛋白,我们叫它多药抗性蛋白(MDR/MRP),大部分多药抗性蛋白属于A TP结合盒式蛋白[1](ATP-binding cassette transporter,ABC蛋白),ABC蛋白是一个古老而庞大的蛋白质家族,是一类A TP驱动泵。1976年首次有文献报道ABC蛋白是癌症药物治疗中对多种天然药物产生抗性中表现为170 kDa P-糖蛋白,后来,转染实验提供了确切的证据,在哺乳细胞中第2次发现ABC蛋白的过表达与肿瘤细胞的多药抗药性(MRP)密切相关,是导致化疗失败的主要原因,约 40%的患者的癌细胞内该基因过度表达[2]。ABC转运蛋白主要包括P-糖蛋白、多药抗药相关蛋白和乳腺癌抗药蛋白,它们属于同一家族,具有保守的功能结构域和多样化的生物学功能。MRPs多药抗性转运蛋白是其中一种,能利用水解ATP的能量将各种药物从细胞质内转运到细胞外,这个新的分类定义了多药抗性蛋白(MRPs).在体内和体外研究中指出了它和抗药性的相关性[3-4]。

已经确定的恶性疟原虫ABC蛋白质超家族有16个成员,其中11个被认为是药物流出转运蛋白,现在展开的P f ABC基因系统分析法把ABC超家族分为7个亚科群,亚科B是最大的,包含有7个成员,别的和药物转运有关的家族成员有P f ABCC1,P f ABCC2、P f ABCG1和 P f ABCI3 。决定 ABC转运蛋白的表达和定位的转运蛋白有3个P f MRP1,P f MRP2,和P f MDR5,存在于无性繁殖阶段的寄生虫的细胞膜上[5]。这些活跃在蛋白质膜上的特殊物质可以泵出很多在结构和功能上不同的兼性药物,从而减少细胞内的药物聚集,导致药物产生抗性。

ABC蛋白的典型结构包括6个跨膜片段形成的跨膜区(TMD)的和w alker A和walker B基序形成的核苷酸结合区(NBD),ABC蛋白也编码完全转运体(TMD-NBD-TMD-NBD)或部分转运体(TMD-NBD),用来转化结合一个功能单位[6],其中pfMRP1和pfMRP2是完全转运体,P f MDR5是半转运体。除它的正常生理功能之外,近年发现,ABC蛋白广泛存在于多种正常的组织和器官,参与药物和内、外源毒素的吸收、分布和排泄,行使解毒和防御保护的作用。

2 pfMRP1在抗疟药中的作用

p fMRP1在抗疟药中的作用是近几年疟疾研究中的重点,pfMRP1的蛋白质编码PFA 0590w,(http://p lasmodb.org/)由 1 822个氨基酸组成,HMMTOPv2软件分析pfMRP1的二级结构由12个双螺旋结构构成,分布在两个跨膜区(MSDs),在NDB附近形成典型短的MRP[4],几个已经确定的突变位点都位于 pfMRP1基因的功能区MSDs,NBDs附近,位于这些区域可以控制它的底物特异性和增加ATP结合水解蛋白的能力[7],这些结构的天然变异提示pfMRP1具有不同的转运能力,最近有文献报道更进一步表明,pfM RP1的分解降低了疟原虫把氧化废物转运出细胞的能力,使疟原虫对周围的环境敏感性增加,体外研究中也发现使疟原虫对氯喹,奎宁,青蒿素,哌喹和伯氨喹的敏感性增加[4],临床药效试验中发现I876突变在蒿甲醚-本芴醇(AL)治疗后复发的病例中的选择性,K 1466突变在磺胺多辛-乙胺嘧啶(S-P)治疗后复发的病例中的选择性[8],而且,在抗疟药体外试验中发现,pfMRP1的突变可以降低所有药物敏感性,除了咯萘啶,所有这些研究有力的说明了pfMRP1和几种结构不相关的抗疟药都有关,由此推理了抗疟药的抗药性机制,尤其揭示了当前以青蒿素为基础的综合治疗(ACT)的抗药性机制,pfM RP1是青篙素和ACT其他成员的产生交叉抗性的基础。在氯喹和奎宁的体外研究中揭示了pfMRP1的转运机制,可以将各种药物从细胞质内转运到细胞外,从而降低细胞内的药物浓度,使细胞对药物产生抗药性[4]。MRPs有个特殊的机制影响药物的抗性,就是通过增加物质量对抗药物转运,这尤其对药物的特异性靶点有作用,这一机制在抗叶酸素的研究中普遍存在[9]。

最近研究还表明,pfMRP1转运抗疟药和细胞膜上氧化型谷胱甘肽(GSSG)转运有关,通过对大量受捐者诱导氧化应激实验,可以得出在恶性疟原虫中pfMRP1起着一个重要的GSSG流出泵作用,这种泵作用也可以在人类MRPs中观察到[10],这揭示了pfMRP1具有多样化的生物学特性。

3 pfMRP1单核苷酸多态现象对不同药物的特异性

pfMRP1有个重要的功能是可以降低氯喹、奎宁、青蒿素的敏感性,它的多态现象增加了所有蛋白质的转运功能从而降低了所有相关药物的敏感性,也可以通过降低蛋白质的转运效率而增加药物的敏感性,除了S-P,pfMRP1多态现象对S-P的选择性不大,这一观点在乙胺嘧啶和青蒿素的抗药性研究中已经得到证实,pfMRP1多态现象介导了青蒿素和ACT中当前运用的其他药物的交叉抗性,增加一种药物的pfM RP1的活性可以降低ACT成员中所有药物的敏感性,包括本芴醇,甲氟喹和阿莫地喹[4],这是当前疟疾治疗的最大难题。

这里有三个因素解释我们观察到的不同的突变位点影响不同药物的敏感性的原因,尽管这些都是pfMRP1的潜在转运功能。(1)最重要的因素是pfMRP1有药物特异性,即使MRP的酶结合位点有重叠,突变位点只是有助于有些酶的结合,而不是所有酶的结合,导致了核苷酸多态性只和特定药物有关系。(2)可能pfMRP1在甲氟喹和本芴醇在细胞质靶点中的作用比在食物泡的靶点靶点更重要,氯喹,阿莫地喹也是这样。(3)有些药物可以诱导氧化应激反应,pfMRP1的附加效应转运GSSG,把细胞从氧化压力下解救出来[11],转运GSSG和药物有不同的酶结合位点[4]。

4 pfMRP1,pfMDR1和pfCRT在抗药性产生过程中的协同作用

pfMRP1潜在影响抗药性方面和其他恶性疟原虫膜转运体有协同作用,比如恶性疟原虫多药抗性基因 PfMDR1和恶性疟原虫氯喹抗性相关基因P f CRT。

PfMDR1是食物泡膜的输入者,逆方向影响药物转运,野生型突变位点和基因扩增可以降低甲氟喹,本芴醇和青篙素等药物的敏感性,而会增加氯喹和阿莫地喹的敏感性,甲氟喹,本芴醇在食物泡外面有它的靶点[12],PfMDR1对食物泡的转运效率可以通过各自的靶点降低这些药物的敏感性,相反的,PfMDR1在比较低的转运效率情况下可以增加氯喹和阿莫地喹的敏感性,这可能是因为它的靶点在食物泡内部的原因。

P f CRT是食物泡膜的输出者,最初是在氯喹的抗药性中发现的,P f CRT的天然76T突变比野生型的突变有更好的转运能力,P f CRT可以使药物从食物泡中溢出,这将降低氯喹和阿莫地喹的敏感性,当P f CRT返回到它的作用部位,到甲氟喹和本芴醇的靶点,又会增加甲氟喹和本芴醇的敏感性。

pfMRP1以相同的方式影响大多数药物,它对抗疟药物转运的影响是显而易见的,直接作用于细胞膜和细胞质。但它可以通过P f CRT对药物的活动,进一步作用于食物泡药物的靶点[13],可见,这几种抗药性基因共同影响药物的抗药性。

5 pfMRP1基因突变的类型特点和基因突变的检测方法

在对pfMRP1基因的研究中,目前确定的多态性(SNPs)一共有4个,这几个点突变导致编码氨基酸的密码子发生改变,分别为 Y 191H和A 437S,I876V和K 1466R,这几个突变位点位于蛋白质功能区附近(特别是NBDs)[3]。pfMRP1有显著的生物多样性,一些已经确定的多态性有地域性的特点。在非洲的疟疾感染样本中,I876V和 K 1466R的突变比较常见,K 1466R突变只有在非洲和新几内亚岛样本中检测到,I876V突变现象遍及全球疟疾流行区,在亚洲和大洋洲的样本中最常见的突变位点是Y191H和A 437S[14],这2个位点的突变率很高。

对pfMRP1基因突变的检测最直接和有效的方法就是进行DNA测序分析,各大洲的恶性疟分离株上的突变位点都是通过这种方法发现的[15]。但是若对待测样本全部进行DNA测序,成本较高,无法广泛应用,针对 Y191H和A 437S,I876V和K 1466R这几个突变位点在恶性疟原虫抗药性中的关键作用,如果能够检测到这一位点的突变与否,就能初步判该株恶性疟原虫是否为抗性株。这就需要设计特定引物通过PCR扩增出包含这几位氨基酸密码子的DNA片段进行分析,目前国外已经有报道通过巢式PCR法扩增出包含这几个突变位点密码子的DNA片段[9],再通过特异性的限制性内切酶进行酶切的限制性长度多态性分析(RFLP),通过酶切片段的不同来判断是否存在基因突变 。巢式PCR法是用两套引物(内、外引物)作两轮PCR,第1轮PCR扩增出一段较长片段,作为第2轮PCR的模板再进行扩增,使用巢式引物进行多轮扩增提高了PCR反应的特异性和灵敏度,这样可以提高实验结果的可信度和可靠度。

6 结 语

pfMRP1在疟疾抗药性产生中发挥很重要的作用,我们可以通过分子生物学技术,掌握它的生物多样性的特点,对位于MSDs,NBDs功能区附近的突变位点进行研究,检测出各个疟疾流行区对特定药物的敏感性,指导临床用药及新的抗疟药的研制,降低药物产生抗性的概率,控制疟疾的流行和传播。

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