安徽三界地区啮齿动物感染恙虫病东方体调查*

操 敏,王忠灿,陆年红,黄华东,郭恒彬,王长军,张 兴,唐家琪

2.解放军73046部队卫生队,三界 239421

安徽三界地区啮齿动物感染恙虫病东方体调查*

操 敏1,王忠灿1,陆年红1,黄华东2,郭恒彬1,王长军1,张 兴1,唐家琪1

目的调查安徽三界地区啮齿动物自然感染恙虫病东方体分离株,并确定其基因型别。方法流行季节在野外用鼠笼捕鼠并鉴定鼠种、携螨率;巢式PCR对鼠脏器进行恙虫病东方体56 kD基因片段检测;将鼠脏器接种小白鼠进行病原体分离,PCR扩增分离株Ot 56 kD基因片段,并将目的片段进行测序,基因序列同源性及进化分析。结果捕获啮齿动物数及其携螨率,黑线姬鼠60%(15/25);褐家鼠45.5%(5/11);东方田鼠和鼩鼱各2只,均阴性。40只野鼠脏器有 3只恙虫病东方体PCR扩增阳性,阳性率为7.5%;从黑线姬鼠标本中分离到1株恙虫病东方体Sanjie,56 kD基因片段测定该株与台湾TT0711a和N T0511b分离株同源性最高(98%),系统发生树分析也显示与Kawasaki型共处于同一分支。结论安徽三界地区存在鼠类恙虫病东方体自然感染,黑线姬鼠为其主要宿主,当地恙虫病东方体属Kawasaki基因型。

恙虫病东方体;啮齿动物;病原分离;分子流行病学

三界地区位于安徽省东北部边缘,地处江淮分水岭地带,属低山丘陵地形。2007年11月当地驻军某部发生一起恙虫病暴发流行[1],仅1个连队1 w内就出现19例临床症状典型的恙虫病病例。严重威胁着广大指战员及驻地群众的健康。当地之前无恙虫病病例及流行报告,特对三界地区啮齿动物自然感染恙虫病进行调查,并鉴定病原体分离株的基因型别,为防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 地理、气候、植被等项调查 对气象局、环保局、林业局等机关的资料及县志进行查询与现场查看相结合。

1.2 宿主动物的调查 自2009年10～11月在三界地区不同景观如房舍旁、菜地、花生地、草丛、田埂边等鼠类较多区域布鼠笼捕鼠,黄昏放置晨起收回,鉴定鼠种,确定优势鼠种,无菌操作取肝、脾、肾脏。收集体表寄生物,计算鼠携螨率。

1.3 巢式PCR法检测鼠脏器标本恙虫病东方体DNA 使用INVITROGEN DNA提取试剂盒提取鼠脏器DNA作为模板,引物设计针对恙虫病东方体56 kD主要表面抗原基因,巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异性。第一轮PCR反应引物 P1:5′-TACAT TAGCTGCGGGTA TGACA-3＇,P2:5′-CCAGCATAATTCT TCAACCAAG-3＇,预计扩增约340bp基因片段;第二轮 PCR反应引物P3:5′-TAGAGCAGAGCTAGGTGTTA TGTA-3＇,P4:5′-TAGGCAT TATAGTAGGCTGAGG-3＇,预计扩增约 180bp基因片段。反应程序为 95℃变性 5 min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃1 min,35个循环,72℃7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,PCR试剂盒购置TAKARA公司。

1.4 恙虫病东方体的分离与鉴定

1.4.1 恙虫病东方体的分离 2009年10～11月从三界地区野外草丛、花生地、田埂等生境捕鼠,无菌操作取肝、脾、肾脏按同日同生境同种鼠2～6只为1份,共7份,包括黑线姬鼠3份,褐家鼠2份,东方田鼠和鼩鼱各1份。以上标本分别添加SPG蔗糖磷酸缓冲液,制成10%悬液,经腹腔接种15～18g昆明种小白鼠4只/组,0.5mL/只,每天观察2次。阴、阳性判定标准见文献[2]。判定为分离恙虫病东方体阳性的小白鼠,无菌取肝、脾、肾置-30℃,保存备用。

1.4.2 PCR鉴定 按常规方法从恙虫病东方体阳性感染的小白鼠脏器中提取DNA作为模板。用上述巢式PCR鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.3 序列测定及分析 将扩增的基因片段送至TAKARA公司测序。同时递交GENBANK获序列号为:JF04210。测得的序列BLAST,用Bioedit软件将序列长度编辑一致并进行格式转换后,用clustal X软件与各参考株序列进行多重排列、比较和同源性分析,软件Mega 4.0中Distances程序计算一组序列内及组间基因进化距离(Evolutionary distances),利用最短进化长度算法(minimal evolution)进行系统进化树分析。

2 结 果

2.1 丘陵平原地形 三界地区位于安徽省东北部边缘,地处江淮分水岭丘陵地带,属低山丘陵地形,北纬32°47′,东经117°58′。属于北亚热带与温暖带过渡地带的半湿润气候,年平均气温15℃,无霜期219 d,十分适宜花生、山芋等作物种植。其它种植作物主要有水稻、小麦、油菜、芝麻、玉米、小烟等。植被较丰富,适于恙螨、啮齿动物等孳生。

2.2 鼠类宿主及其携螨率 2009年10～11月在三界地区捕获啮齿动物40只,包括黑线姬鼠25只,褐家鼠11只,东方田鼠2只,鼩鼱2只,以黑线姬鼠为优势鼠种,占62.5%。黑线姬鼠,褐家鼠,携螨率分别是60%(15/25)、45.5%(5/11)。东方田鼠,鼩鼱均阴性。

2.3 分子流行病学检测 套式PCR法检测40只野鼠,结果从3只黑线姬鼠体内扩增出约200 bp基因片段,见图1。a,b,c,与预计目的基因片段大小相符。PCR扩增阳性率为7.5%。

图1 鼠脾中Ot特异性片断扩增产物电泳图(a-c:野鼠脾PCR产物;d:接种小鼠脾PCR产物;M:1kb marker)Fig.1 The electrophoresis results of PCR products from the spleen of rodents and micea-c:PCR products from the spleen of rodents;d:PCR products from the spleen of inoculated mice;M:1kb marker.

2.4 东方体的分离与鉴定

2.4.1 东方体的分离 用7份鼠脏器标本(黑线姬鼠3份,褐家鼠2份,东方田鼠和鼩鼱各1份)分别接种小鼠,结果仅1份黑线姬鼠脏器接种小鼠出现典型东方体感染症状(如耸毛,弓背,厌食,腹部增大),腹壁刮液姬姆萨染色光镜下见紫红色东方体颗粒,见图2。

2.4.2 PCR鉴定 将该小鼠提取脏器DNA做模板,用恙虫病东方体特异的套式PCR扩增,获得约200 bp的基因片段。

2.4.3 序列测定 将该基因片段测序(序列已递交GenBank,列号:JF04210),序列 BLAST显示该株东方体与台湾T T0711a株和NT0511b同源性最高为98%。系统发生树分析也显示,Sanjie和TT0711a,NT0511b在同一分支,它们又与Kawasaki型共处于同一分支。见表1与图3。

图 2 Ot感染小白鼠腹壁刮液 Giemsa涂片Fig.2 Giemsasmearoftheperitonealcellsofot infectious mice

表1 17株恙虫病东方体sta 56基因的进化距离及其标准差Table 1 Evolutionary distances between 56 kD gene sequences of 17 strains of O.tsutsugamushi

图3 17株恙虫病东方体sta 56基因序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of O.tsutsugamushi strains constructed based on nucleotide sequence of sta 56

3 讨 论

近年来,我国恙虫病病例断续发生。此与经济的发展和砍伐森林、兴修水利、筑路、旅游等开发自然资源的行为的增多、与自然疫源地的接触密切,从而导致病例不断增多。1985年以前我国恙虫病仅流行在北纬31°以南的广大地区,1986年后长江以北的山东、江苏、山西、河北、天津等地相继发生恙虫病流行[3-5]。迄今,我国已报导有22个省区均有该病的发生和流行。

恙虫病在安徽省属于新发传染病。历史上仅休宁1982年报告1例病例[7],接下来25年无病例报告,直到2007年11月,安徽三界地区某部驻军出现一起恙虫病暴发流行[2],之后,恙虫病在安徽省呈高发态势。2008年阜阳出现恙虫病暴发流行[8],病例78例,同年,蚌埠也出现数十例恙虫病病例,2009年,阜阳再次出现恙虫病暴发疫情,三界地区近几年也时有散在病例发生。这提示安徽省存在恙虫病疫源地。安徽省的恙虫病疫情均发生在10～11月,为秋季型恙虫病。迄今,长江以北地区所报告病例均属秋冬型。目前该省恙虫病疫源地调查工作鲜有报道,病原分离等工作尚属空白。刘红等[9]通过对安徽广德、明光和怀远3县农村613份人群血清感染恙虫病抗体水平的监测发现,3地以明光市恙虫病血清阳性率最高,达 71.50%;广德县较低,为15.50%。家畜血清恙虫病阳性率也以明光市最高,达80.39%,怀远县最低,为2.08%。三界地区位于明光境内,是部队驻地,当地植被丰富,适合啮齿动物及螨类孳生,为丘陵平原型疫源地。秋季野外啮齿动物种类主要是黑线姬鼠、东方田鼠和鼩鼱,农舍室内为褐家鼠,以黑线姬鼠为优势鼠种,为主要宿主。此次从黑线姬鼠体分离到一株东方体,为安徽省首次报告分离的地方株。在中国,恙虫病东方体的基因型别主要以Gilliam、Karp和Kawasaki型为主。在长江以南地区主要表现为Gilliam和Karp型[10-11]。长江以北地区分离株主要为Kawasaki和Gilliam型[12-13]。本研究对东方体56 kD序列分析结果显示,与台湾TT0711a和NT0511b株同源性最高为98%,进化距离最短为0.066,在进化树上,它与Kawasaki在同一分支,提示三界地区恙虫病东方体分离株属Kawasaki型,这与地理位置较近的江苏和山东省报道的东方体基因型相似。

[1]汪茂荣,于乐成,何长伦,等.安徽地区一起恙虫病暴发流行的调查分析[J].中华实验和临床感染病杂志,2008,2(3):174-177.

[2]郭恒彬,徐毛华,于明明,等.恙虫病立克次体弱毒株分离方法的研究[J].中国人兽共患病杂志,1992,8(5):5-6.

[3]陈香蕊,关乡占,于强,等.山西省首次流行恙虫病的证实[J].中国人兽共患病杂志,1996,12(2):2.

[4]李忠,孙桐,王勤忠,等.山东省恙虫病调查[J].中国公共卫生,2003,8:74-75.

[5]李春明,陈素良,孔令义,等.河北省某疫源地恙虫病防制措施效果观察[J].中国媒介生物学及控制杂志,2001,6:44-45.

[6]姜仁杰,沈进进,张盐珠,等.盐城市2006年恙虫病爆发的流行病学调查[J],疾病控制杂志,2007,11(6):5 636-638.

[7]胡成炎,程福坤,汪家华等,等.皖南山区恙虫病一例报告[J].安徽医学,1983,4(4):250.

[8]吴家兵,胡岱霖,何凡,等.安徽省阜阳市首起恙虫病暴发疫情的流行病学调查[J].中华疾病控制杂志,2009,13(6):651-653.

[9]刘红,曹明华,张永根,等.安徽省不同地区人群和家畜恙虫病血清流行病学调查[J].安徽预防医学杂志,2010,16(1):12-13.

[10]Cao M,Guo HB,Tang T,et al.Spring Scrub Typhus,People's republic of China[J].Emerging Infectious Disease,2006,12(9):1463-1465.

[11]彭桂福,王珊珊,黄佳亮,等.南澎列岛恙虫病东方体分离株的基因分型[J].中国人兽共患病杂志,2001,17(3):43-45.

[12]陈香蕊,牛华,张永国,等.山西恙虫病立克次体分型及其56-kD蛋白基因序列分析[J].中国人兽共患病杂志,1998,3:21-23.

[13]郭恒彬,唐家琪,李先富,等.PCR/RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究[J].临床检验杂志,1998,2:8-11.

Investigation on rodents infection ofOrientia tsutsugamushiin Sanjie,an area of An Hui province,China

CAO Min,WANG Zhong-can,LU Nian-hong,HUANG Hua-dong,GUO Heng-bin,WANG Chang-jun,ZHANG Xing,TANG Jia-qi
(Centers for Disease Control and Prevention of Nanjing Command,Nanjing,210002China)

The purpose of this study was to investigate the rodents infection ofOrientiatsutsugamushiand determine the genetype of theOtstrain in Sanjie,anhui province.In epidemic season,the rodents were capturied and the mites were collected in the field,then the dominant kind of rodents were determined after classifying and calculating them.The DNA of 40 rodent spleens were detected by PCR;The mice were peritoneal injected by the homogenized spleen of rodents to isolateorientia tsutsugamushiin this region.The partial gene ofOt56 kD outmembrane protein was amplified from the spleen of infectious mice and sequneced.Phylogenetic tree was constructed on the 56 kD gene of 17 strains.The results showed that the captured rodents and the rates of carrying mite were Apodemus agrarius 25,60%(15/25);Rattus norvegicus 11,45.5%(5/11),Microtus fortis 2 and S.inutus Linnaeus with negative carrying mite rate respectively;The DNA of 3 spleen of rodents were positive by PCR usingOtspecific primers.OneOtstrain named Sanjie was isolated from Apodemus agrarius.The gene sequence of Sanjie 56kD protein showed 98%homology with T T0711a and NT0511b strans isolated from Taiwan.Phylogenetic analysis showed that Sanjie was in the same branch with T T0711a and NT0511b,and the three were also in the same branch with kawasaki strain.This study indicated thatOtinfection was presented in rodents from Sanjie and Apodemus agrarius was the main host.The genotype of Sanjie was determined as Kawasaki type.

scrub typhus;rodent;Orientia tsutsugamushi;pathogen isolation;molecular epidemiology

R376

A

1002-2694(2011)08-0721-03

*南京军区南京军区重点科研项目(08Z034)和2010年度南京军区医学科技创新课题(10MA129)联合资助

操敏,Email:anniecao2001@yahoo.com

1.南京军区疾病预防控制中心,南京 210002;

2.解放军73046部队卫生队,三界 239421

2011-04-22;

2011-06-27