结核分枝杆菌原核泛素样蛋白的研究进展＊

张 娟（综述），袁 俐（审校）

结核分枝杆菌原核泛素样蛋白的研究进展＊

张 娟（综述），袁 俐（审校）

结核病是人类致死的主要感染性疾病之一。尽管人体内存在有效的控制结核杆菌生长的机理，大部分人感染结核分枝杆菌后，不会发展成结核病，但是结核杆菌在机体中很难被消灭［1］。近年来，随着Pup（Prokaryotic ubiquitin－like protein）的发现及其功能的深入研究，为制定结核病患者的治疗策略提供了新的依据。本文简要介绍结核分枝杆菌Pup的发现、结构特点以及Pup修饰系统中所涉及的酶等一些最新进展。

1 Pup的发现

早在上世纪70－80年代，研究人员从小牛的胰脏中发现了泛素，其参与蛋白水解过程，在很多基本的细胞过程中都起很重要的作用。以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯发现了泛素调节的蛋白降解过程，为从分子水平上理解细胞控制一些非常重要的生化过程成为了可能，因此在2004年被授予诺贝尔化学奖。但是，直到2008年年底，瑞士联邦理工学院分子生物学与生物物理学研究所Eilika Weber－Ban所带领的研究团队才在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中发现了一种特殊的、被称作Pup的小蛋白，它可以附着到其他蛋白质上决定该蛋白命运，进而清理蛋白质，控制或调节细胞内其他重要的生理过程［2］。

2 Pup及结构特点

在真核生物中，通常利用泛素化对标记的蛋白质进行蛋白酶体降解。近年来，发现细菌中也存在着类似的标记系统。结核分枝杆菌的Pup是非真核生物中发现的第一个类泛素蛋白。类泛素蛋白是一类小分子蛋白质，它们不仅在结构上与泛素相似，而且也可以共价连接到其他的蛋白质上对其进行共价修饰［3］。

Pup是由64个氨基酸残基组成的内在无序的蛋白，Pup蛋白的编码基因位于Rv2111c。Pup可以在结核分枝杆菌菌体内对一些特定蛋白进行修饰，使他们被菌体内的蛋白酶体所降解。Pup既不是β－grasp蛋白也不是类泛素蛋白，它通过C末端的谷氨酰胺位点与靶蛋白的赖氨酸位点相连。Pup末端的谷氨酰胺在与靶蛋白连接时或连接之前会变为谷氨酸。

虽然真核生物中的各种类泛素蛋白在序列上的相似性比较低，但它们的三维结构却高度保守，都呈现典型的类泛素折叠模式［4－5］。涂晓明等人研究发现，与其它类泛素蛋白超家族的成员相比，Pup不但在序列上相似性很低，在结构上也呈现出完全不同的折叠方式。借助结构预测并结合圆二色（CD）和核磁共振（NMR）等手段，证明Pup是一个内在无序蛋白（intrinsically disordered protein，IDP）。更进一步，利用化学位移编辑（CSI）和异核｛1H｝－15N NOE方法，确认在Pup的C端有残余的二级结构。在研究中，还用表面等离子共振（SPR）确证了Pup与结核分枝杆菌蛋白酶体ATP酶（mycobacterium proteasomal ATPase，Mpa）的相互作用，并利用NMR微扰的方法检测了Pup上参与相互作用的区段。结果显示Pup很可能通过其C端的30－59区段利用疏水相互作用与Mpa结合。另外，系统进化分析清晰地表明，Pup属于一个独特的、趋异的进化分支，是类泛素蛋白中分支最早、最深的一个家族［6］。

3 参与Pup修饰的酶系统

3．1 Pup脱酰胺酶（Dop）的脱酰胺作用 在真核生物中，靶蛋白通常会被多泛素链标记［7－9］。复杂的调控系统与蛋白酶体有关，可以识别多泛素链，也可以为其他的泛素化修饰过程转移和再循环泛素单体［10］。目前，对于Pup是否形成泛素链，是否与泛素蛋白类似，是否可以再循环等未见报道。

而泛素蛋白与Pup蛋白有一个共同的特征，在他们的C－羧基端，都存在一个双甘氨酸序列（Gly－Gly）。泛素蛋白通过C端的甘氨酸羧化物与靶蛋白的赖氨酸结合。与泛素蛋白不同的是，Pup通过C端的谷氨酰胺（Q，Gln）的羧化物与靶蛋白赖氨酸结合。实验中通过质谱研究发现，Pup结合靶蛋白时，并不需要蛋白水解C端的GGQ序列。质谱分析结果表明Pup－靶蛋白片段比理论计算的GGQ序列大1Da，这应该是C端谷氨酰胺的脱酰胺作用造成的，也就是说，C端谷氨酰胺的脱酰胺作用是Pup结合靶蛋白的先决条件［11］。

研究人员在试管内模拟Pup结合到蛋白质上的方式时发现了一种Pup脱酰胺酶（deamidase of Pup，DOP）（编码基因位于Rv2112），并证实在结核分枝杆菌中，Dop酶作为一种特殊的Pup脱酰胺酶，在Pup与靶蛋白结合之前，可以脱去C端的谷氨酰胺基［12］。Striebel等人发现Dop与泛素修饰过程中的E1酶、E2酶和E3酶没有同源性。生物结构分析表明Dop和蛋白酶体辅酶因子（proteasome associated factor，Paf A）很可能属于羧化物－氨连接酶超家族，类似于γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶［10］。这个家族的酶催化连接反应，包括磷酸化一个与氨连接的羧化物，导致一个酰胺连锁反应。而脱酰胺作用需要ATP作为辅助因子并不是它的分解作用。在生物体中，脱酰胺作用可能作为一种调控机制，使Pup终止于谷氨酰胺。该结果为针对肺结核患者，尤其是病原体已产生抗生素耐药性的患者制定治疗策略提供了新依据。

3．2 Paf A 的结合作用 Pearce［2］等人研究发现，Pup与结核杆菌蛋白酶体的通路有关，Pup与赖氨酸共价结合在特定的蛋白上，比如FabD，Fab D的泛素化导致它的降解，这种蛋白类似于真核生物的泛素结合蛋白。这种标记的结合反应，被发现依赖于另一种分枝杆菌蛋白—蛋白酶体辅酶因子Paf A（Rv2097）［13－14］。

因为Paf A与γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶具有同源性，并且研究发现，在结核分枝杆菌Paf A突变株中，未能检测到被Pup标记的蛋白，Paf A可能与Pup和底物连接有直接的关系。Lyer［15］等人研究证明Paf A是Pup的连接酶，Paf A能使脱酰胺作用后的Pup与靶蛋白结合。

Frank Striebel研究发现［12］，Dop酶和Paf A酶可以催化独立的反应。Dop酶催化Pup蛋白的C－谷氨酰胺的脱酰胺过程，使Pup－GGQ转化成Pup－GGE，这一过程需要ATP作为辅助因子。而Paf A催化Pup－GGE与靶蛋白的结合过程，异肽键的形成需要ATP水解成ADP。Pup的脱酰胺过程和Pup与靶蛋白的结合过程是独立的，不相互影响。

3．3 Dop和Paf A的同源性 为了寻找与Pup相互作用的蛋白质，从而进一步理解Pup的功能，Frank Striebel［12］等人利用下拉实验，结合质谱法，胰蛋白酶消化等实验显示Dop、Paf A和Mpa作为Pup蛋白的关联配偶体。在下拉式实验中，也证实Dop是Paf A的同源蛋白（32%相同，50%同源）。

基因组分析显示，Paf A是由含有61个碱基的开放读码框所编码，其中的59个碱基包含编码Dop的开放读码框。这些蛋白经多序列排列显示出在大约27个氨基酸后，N端存在一个标记序列，从而可以把Dop簇从Paf A簇中分离出来。而这两个蛋白簇在90－300个氨基酸的区域，显示高的同源性。相反，在300－500个氨基酸的区域，显示适中的同源性，并且只有Dop蛋白有C末端伸展。由于较长的N端序列和C末端伸展，大体上，Dop蛋白会比它的同源蛋白Paf A长大约50个氨基酸。

总而言之，两个同源的蛋白Dop和Paf A都存在于结核分枝杆菌基因组中，但是功能不同。

3．4 Mpa 蛋白酶系统普遍存在于古细菌和真核生物中，近年来发现，也存在于一些放线菌属中［16］。类似于真核生物，结核分枝杆菌蛋白酶体系统包含一个20S蛋白酶体和Mpa，它们与真核生物的类似物相同，在结构上高度保守［17－19］。在动物实验中发现，Mpa蛋白水解酶体系统对于结核分枝杆菌导致的致死性感染是至关重要的［20］。

Mpa包含一个N端螺旋结构域和一个可以调控多领域活性的ATP酶结构域，形成六聚物［19，21］。Mpa的结构与其他的ATP酶－蛋白水解酶体一样，都含有古细菌属中能激活蛋白酶体的核苷酸酶PAN和红球菌属中环形ATP酶复合物ARC［22－23］。

Pup通过C端的谷氨酸盐与底物的赖氨酸形成异肽键，与底物共价结合。在这一结合过程的产物中，发现部分PupC端与Mpa相互作用，而部分N端则促进底物的伸展和降解［24－25］。因而与Pup结合的底物可能被转移给蛋白酶体，这一过程通过Mpa特异性的识别Pup来完成的，但关于调控Mpa识别Pup的分子机制仍不清楚。

Tao Wang［26］等人运用生物化学和基因遗传方法，分析了Mpa的晶体结构和Pup与Mpa结合的共价晶体结构，发现Pup最初结合底物时是未折叠状态；无规则的Pup以Mpa螺旋为模版，折叠成α螺旋；与Pup结合的底物蛋白，在ATP水解的条件下，被拉成ATP蛋白酶体的中心管。研究人员建立了结核分枝杆菌Pup介导的蛋白酶解模型，提出了底物蛋白结合Pup蛋白水解酶体的机制，并提出折叠的Pup被诱导的结合反应对于蛋白降解的是必需的。

Pup和ATP蛋白水解酶体在序列上的高度保守，以及折叠Pup被诱导的结合反应，作为一种普遍的识别机制，存在于细菌的蛋白酶体系统中。Pup与Mpa的相互作用在细菌中是独特的。细菌与真核生物蛋白酶体系统存在的差异，为我们开发一种特殊的结核分枝杆菌蛋白酶体抑制剂，作为结核病的分子治疗方法，提供了依据。

4 展 望

目前，Pup在结核分枝杆菌中的研究仍处于起步阶段。瑞士联邦理工学院研究人员发现，虽然细菌和人类的标记蛋白在功能上都是确保细胞蛋白质的降解，但它们的结构和作用方式却明显不同。由于细菌中的蛋白标记系统与人体不同，因此针对细菌Pup系统的药物对人类副作用很小［26］。

结核分枝杆菌中依赖ATP酶的蛋白水解酶体系统Mpa在调控蛋白活性和定位中发挥着重要的作用。对Pup的分子机制特别是Pup的结构、Pup修饰酶的识别等方面已经有了初步了解。然而对Pup的理论研究及应用情况还了解甚少。深入研究Pup的作用机制和对结核分枝杆菌的分子治疗方法带来新的希望，开发特殊的结核分枝杆菌蛋白水解酶体抑制剂，将成为可能。

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R378．91

A

1002－2694（2011）10－0940－03

＊国家自然科学基金资助项目（30960356）

袁俐，Email：yuanli832000＠sina．com

新疆石河子大学医学院病原微生物学与免疫学教研室，石河子 832002

2011－03－20；

2011－05－13