三氧化二砷对胃癌细胞变性坏死的方法和机制的研究

刘颖 程朱

(1.长春医学高等专科学校 长春 130031; 2.长春市儿童医院 长春 130021)

近年来,对肿瘤细胞死亡的研究越来越引起重视,用AS2O3治疗急性白血病已有了突破的进展,其治疗机制是诱导肿瘤细胞凋亡主要表现在细胞核超微结构改变。最近我们发现AS2O3重点在线粒体的形态改变及bcl-2、bax的表达,以阐明AS2O3引起胃癌凋亡的作用点,并证实AS2O3是一种线粒体毒性药物。

1 材料与方法

1.1 细胞和用药方法

细胞为北京肿瘤研究所人胃癌细胞株,将细胞培养在培养瓶和培养板,内置盖玻片,每孔接种细胞5×104个,分1、23umol/L浓度AS2O3及1组对照组,在第2,4,6,12,24h取标本检查。

1.2 透射电镜检查

收获细胞离心团,2.5%戊二醛固定,常规电镜制样,日立H-300电镜检查。

1.3 流式细胞仪检查

DNA倍体测定按常规制样,碘化丙锭染色,检查细胞周期和凋亡峰。Annexin-v检测,取培养细胞106用PBS洗,离心。Annexin-v-fluos标记试剂盒购自Boehringer Mannheim公司,按试剂盒方法作活细胞染色,流式细胞仪检测。

1.4 罗达明123(Rhodamin123)荧光探针标记

Rho123,w381,MolecularProbes公司产品。细胞在24孔板盖玻片上生长。1,2,3umol/L AS2O3作用,定时取片,Rho123(10ug/mL)染色,CO2培养箱温育,在落射荧光显微镜下检查,激发光505nm,发射光534nm。

1.5 免疫组织化学检查

用细胞离心机,收集脱落细胞,4%甲醛固定。bcl-2、bax免抗人多克隆抗体及SP免疫组织化学试剂盒(Santaruz公司产品),按试剂盒操作方法。

2 结果

2.1 凋亡细胞的形态改变

培养细胞加不同浓度AS2O3后24h均出现细胞凋亡,多数细胞核染色质凝集靠边呈典型凋亡细胞核改变。

2.2 细胞凋亡的指标

1umol/L AS2O3作用早期凋亡细胞较少,AS2O32umol/L作用4h Annexin-v显示早期凋亡占7.1%。DNA组方图显示凋亡峰,12h凋亡细胞7.5%,24h凋亡细胞占35%,3umol/L AS2O3作用细胞易进入凋亡后期改变。

2.3 线粒体荧光标记

加药2h线粒体数目增加,4h出现粗大线粒体,多在胞质外带。12h及24h线粒体外形结构不清。

2.4 细胞超微结构改变

不同浓度AS2O3作用2～4h,有的线粒体肿胀,内嵴减少,有电子密度高的不定形物质沉淀,细胞核染色质开始凝集。作用6h可见线粒体嵴消失;12h外膜消失,基质呈气球样,并可见自噬泡。作用24h细胞皱缩,核变圆,染色质凝聚靠边,出现凋亡改变。

2.5 bcl-2和bax表达

不同浓度 AS2O3作用2、6、12、24h时收集细胞,bcl-2蛋白产物免疫组织化学检测呈阴性,bax蛋白产物免疫组织化学染色呈深褐色,为高度表达。

3 讨论

细胞凋亡是一个发展的过程,有其早、中、晚期的改变,不同浓度AS2O3作用于癌细胞4～6h时出现凋亡早期改变;3umol/L AS2O3作用24h凋亡细胞出现晚期改变,多数细胞死亡,出现细胞皱缩,染色质凝集靠边,核膜不完整。线粒体空泡化和外膜破裂呈气球状,胞质呈退行性变。线粒体是细胞进行呼吸链、电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的场所,其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动[1]。线粒体膜通透性改变和跨膜电位改变使线粒体肿胀,位于线粒体内外间隙的细胞色素C进入胞质,激活某些蛋白酶系统[2],是凋亡产生的起源。细胞核改变是核酸酶进入核内使染色质致密化和DNA断裂。

通过我们的实验出现了bcl-2表达下调和bax表达增加,证实这两者参与了细胞凋亡的过程。bcl-2可以预防细胞凋亡,bax能促进线粒体膜通透性改变,使其细胞色素C释放,引起细胞凋亡。我们研究证明诱导细胞凋亡,线粒体在药物作用4h内即开始改变,也可使bcl-2和bax表达异常而产生细胞凋亡,因此认为AS2O3具有线粒体毒性作用,可用于治疗胃癌。

[1]Kunz-S,chaghartLA,HabbersettRC,et al.Mitochondrial function in oncogenttransfected rat fibroblasts isolated from multicellular spheroids[J].Am Jphysiol,1997,273(5pt1):1487～1495.

[2]Basse-wetzelE,NewneyerDD,Grean DR.mitochondrial cytochrome crelease in apoposis occers upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmenbrane depolarization[J].EMBOJ,1998,17:37～49.