猪源益生菌株Bacillus velezensis Z-27产芽孢发酵条件优化

王振海 姜军坡 王选 王世英 朱宝成

益生菌是人们日益关注的抗生素替代品之一，无毒、无害、无副作用，可参与蛋白质和维生素的合成，维持肠道正常菌群的平衡，发挥生物屏障作用，增强免疫力。益生菌的开发及利用在各国均受到重视，其应用于畜禽生产的良好效果早已被大量的试验和生产实践所证实。随着我国养殖业的发展，益生菌制剂作为饲料添加剂具有广阔的发展前景。

芽孢杆菌具有抗逆性强、能产生多种酶和维生素、生产工艺容易掌握等诸多优越性，因此芽孢杆菌类益生菌在畜牧业和饲料行业中得到了广泛的应用。发酵条件优化对工业生产有着重要意义，是产业化的必需环节。通过发酵优化可以提高生产效率，降低生产成本。如秦艳等通过对蜡样芽孢杆菌发酵条件优化的研究，改变了它的生长参数，提高了生物量及芽孢产率；杨莺莺等通过对益生菌D-1液体发酵工艺的研究，提高了益生菌D-1的菌体得率和芽孢产率。

猪源益生菌株Bacillus velezensis Z-27是从健康仔猪的粪便中筛选出来的，对大肠杆菌有显著拮抗活性的优良菌株。本研究以芽孢产率和生物量为指标，通过单因素试验和正交试验对Bacillus velezensis Z-27菌株产芽孢的发酵条件优化，为工业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

猪源益生菌株Bacillus velezensis Z-27，由河北农业大学生命科学学院制药工程系分离并保存。

1.2 培养基

NA培养基、NB培养基，见程丽娟等编写的《微生物学实验技术》。

基础发酵培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.02%，pH值7.0～7.2。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液培养

从-20℃甘油保藏管中用灭菌竹签蘸取少量的猪源芽孢益生菌Z-27菌悬液，接种于新鲜的NA斜面，37℃培养24 h进行活化。从活化斜面挑取Z-27菌苔，接种于装有100 ml NB培养基的250 ml锥形瓶中，220 r/min、37℃，摇床培养18 h后备用。

1.3.2 生长曲线的测定

将上述种子培养液接种于装有100 ml基础培养基的250 ml锥形瓶中，接种量为2%，220 r/min、37℃摇瓶培养，分别在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h取样，以基础培养基为空白，测定发酵液在600 nm条件下的吸光度值，通过吸光度的大小间接衡量生物量，以时间为横坐标、OD600值为纵坐标，绘制益生菌Z-27的生长曲线。

1.3.3 生物量测定

梯度稀释平板培养计数法。用10倍稀释法将发酵液稀释，用移液枪分别吸取10-6、10-7、10-83个梯度稀释液100 μl于NA平板内，用灭过菌的涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂布3个平板，37℃恒温培养24～48 h。对菌落数为30～300个的平板进行菌落计数，用单菌落数目乘以稀释倍数即得发酵液的生物量。

1.3.4 芽孢产率测定

芽孢计数法是把菌液80℃水浴10 min后稀释平板计数，芽孢产率即为80℃水浴计数与发酵液的活菌计数之比。

1.3.5 不同碳源对Z-27菌株摇瓶发酵生物量和芽孢产率的影响

分别以2%的玉米粉、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精、甘露醇、麸皮作为碳源替代基础培养基中的葡萄糖，其它成分不变。以种子培养液接种，接种量为2%、装瓶量50 ml/250 ml、220 r/min、37℃摇瓶发酵24 h后测定发酵液生物量和芽孢产率，比较不同碳源对发酵液生物量和芽孢产率的影响。

1.3.6 不同氮源对Z-27菌株摇瓶发酵生物量和芽孢产率的影响

分别以2%的花生粉、豆饼粉、尿素、硫酸铵、硝酸铵、胰蛋白胨、酵母浸膏作为氮源替代基础培养基中的蛋白胨，以上述试验的最优碳源替代基础培养基中的葡萄糖，其它成分不变。以种子培养液接种，接种量为2%、装瓶量50 ml/250 ml、220 r/min、37℃摇瓶发酵24 h后测定发酵液生物量和芽孢产率，比较测定不同氮源对发酵的影响。

1.3.7 不同无机盐对Z-27菌株摇瓶发酵生物量和芽孢产率的影响

分别添加0.02%的FeSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、MgSO4·7H2O替代基础培养基中的无机盐成分CaCl2，以上述试验的最优碳源和氮源替代基础培养基中的葡萄糖和蛋白胨，其它成分不变。以种子培养液接种，接种量为2%、装瓶量50 ml/250 ml、220 r/min、37℃摇瓶发酵24 h后测定发酵液生物量和芽孢产率，比较不同无机盐对发酵的影响。

1.3.8 Z-27菌株摇瓶发酵正交试验设计

根据以上单因素试验的结果，利用L16（45），选择最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐、pH值及接种量5个因素，进行5因素4水平正交试验。以生物量和芽孢产率为衡量指标，每个试验作3个平行，取平均值。正交试验设计见表1。

表1 Z-27菌株摇瓶发酵正交试验设计

1.3.9 装瓶量对Z-27菌株摇瓶发酵生物量和芽孢产率的影响

根据正交试验结果配制发酵培养基。以种子培养液接种，根据正交试验结果选择最佳接种量，装瓶量分别以30 ml/250 ml、50 ml/250 ml、70 ml/250 ml、90 ml/250 ml，37℃、220 r/min条件下培养24 h，通过测定发酵液生物量和芽孢产率，比较不同装瓶量对发酵的影响。

1.3.10 转速对Z-27菌株摇瓶发酵生物量和芽孢产率的影响

根据正交试验结果配制发酵培养基。以种子培养液接种，根据上述试验选择最佳接种量及装瓶量，37℃，分别在静止、170 r/min、200 r/min、220 r/min条件下培养24 h，通过测定发酵液生物量和芽孢产率，比较不同摇瓶转速对发酵的影响。

1.3.11 温度对Z-27菌株摇瓶发酵生物量和芽孢产率的影响

根据正交试验结果配制发酵培养基。以种子培养液接种，根据上述试验结果选择最佳接种量、装瓶量及转速，分别以25、30、37℃条件下培养24 h，通过测定发酵液的生物量和芽孢产率，比较不同温度对发酵结果的影响。

2 结果与分析

2.1 Z-27菌株生长曲线（见图1）

由图1可知，培养时间为12 h时，发酵液处于生长对数期末期，即此时发酵液中的细菌处于生长旺盛阶段且达到较高的生物量。因此，Z-27菌株的种子液培养时间以12 h为宜，故本文以下各试验中种子液培养时间皆为12 h。

图1 菌株生长曲线

2.2 培养条件优化

2.2.1 不同碳源对摇瓶发酵的影响（见图2）

图2 不同碳源对Z-27菌株生物量和芽孢产率的影响

碳源优化试验结果表明，以玉米粉、葡萄糖、麸皮作为碳源的发酵液芽孢产率都在80%以上，但是麸皮作为碳源的发酵液生物量太低，葡萄糖价格较高，因此选用玉米粉为最佳碳源。

2.2.2 不同氮源对摇瓶发酵的影响（见图3）

氮源优化试验结果表明，以花生粉、豆饼粉作为氮源发酵效果最好，生物量较大，达到4.24×109cfu/ml和4.32×109cfu/ml，芽孢产率也分别为90%和93%。该菌株对有机氮源的利用普遍优于无机氮源，故以豆饼粉为最佳氮源。

2.2.3 不同无机盐对摇瓶发酵的影响（见图4）

由图4可以看出，以Mn2+作为无机盐的生物量和芽孢产率都比较高，生物量达到2.97×109cfu/ml，芽孢产率达到90%。因此，选择MnSO4作为最佳无机盐。

图3 不同氮源对Z-27菌株生物量和芽孢产率的影响

图4 不同无机盐对Z-27菌株生物量和芽孢产率的影响

2.2.4 Z-27菌株摇瓶发酵正交试验结果分析（见表2）

由表2可知，极差值R豆饼粉＞R接种量＞R玉米粉＞RMnSO＞RpH值，可知豆饼粉为主要影响因素，接种量影响次之。2号试验组合发酵液生物量最高，达2.03×1010cfu/ml，芽孢产率为95%。由均值K得出的最佳组合为A2B2C2D2E2，但是在正交试验表中没有这个组合，通过验证试验，该组合发酵液的生物量为2.33×1010cfu/ml，芽孢产率为96%。因此，确定Z-27的最佳培养条件为玉米粉1%、豆饼粉1.5%、MnSO40.03%、起始pH值为7、接种量为2%。

表2 Z-27菌株摇瓶发酵正交试验结果及其极差分析

2.2.5 装瓶量对摇瓶发酵的影响（见图5）

由图5可以看出，当装瓶量为50 ml/250 ml和100 ml/250 ml时芽孢产率达到85%以上，但是装瓶量为100 ml/250 ml时生物量较低，故50 ml/250 ml为最佳装瓶量。

2.2.6 摇床转速对摇瓶发酵的影响(见图6）

由图6可知，转速为220 r/min时生物量较大，达到2.57×109cfu/ml，芽孢产率为94%，故220 r/min条件为最佳转速条件。

2.2.7 温度对摇瓶发酵的影响（见图7）

比较发现，温度为30℃和37℃时芽孢产率达到90%以上，由于30℃时生物量较低，因此选择37℃为最佳发酵温度。

3 结论与讨论

本研究对猪源益生菌株Bacillus velezensis Z-27进行发酵条件优化，确定了Z-27菌株摇瓶发酵的最佳条件为：玉米粉1%、豆饼粉1.5%、MnSO40.03%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、Na2HPO4·2H2O 0.4%，初始pH值7.0，250 ml三角瓶装瓶量50 ml，接种量2%，摇瓶转速220 r/min，发酵温度37℃。优化前发酵液生物量为6.9×109cfu/ml，芽孢产率为82.5%，培养条件优化后生物量可达2.33×1010cfu/ml，芽孢产率达96.0%，芽孢浓度提高了3.9倍。

图5 装瓶量对Z-27菌株生物量和芽孢产率的影响

图6 摇床转速对Z-27菌株生物量和芽孢产率的影响

图7 温度对Z-27菌株生物量和芽孢产率的影响

由于Z-27菌株为芽孢杆菌，菌体较小，自身带有鞭毛，若采用血球计数法，不易进行显微镜下的观察计数。而活菌计数法虽然操作复杂，但适于此类菌种的计数，刘惠知等对蜡样芽孢杆菌计数亦采用了此方法。

发酵优化中以生物量和芽孢产率为主要指标，是因为在饲喂动物时益生素必须含有一定量活菌。一般要求每克益生素含有3亿个以上的活菌体，且活力要强。芽孢杆菌以孢子形式可耐受饲料加工、储藏及胃内酸性环境，对不良贮存条件和饲料加工条件耐受力要强。较高的生物量和芽孢产率有利于产品的加工、储存，可保证其质量。优化后的培养基配方中，氮源（豆饼粉）含量高于碳源，可能是因为豆饼粉是一种天然培养基，也可作为碳源被Z-27菌株所利用。在做不同无机盐对发酵影响的试验时，添加Cu2+、Zn2+后发酵的生物量较低，几乎没有产生芽孢，可能是Cu2+、Zn2+本身抑制菌的生长。

本研究对Bacillus velezensis Z-27菌株产芽孢的摇瓶发酵条件进行了优化，达到了较高的芽孢浓度，为进一步的小试及中试奠定了基础。