茯苓多糖对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响

王庆奎 赵海运 陈成勋 吕志敏 邢克智

中草药多糖是一种免疫增强剂，能够增强水产动物的非特异性免疫功能，提高机体抗病力，与抗生素和化学消毒剂相比具有无药物残留、无污染以及病原菌不产生抗药性等优点[1]。茯苓为中国传统中草药，为多孔菌科植物茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，《神农本草经》中又名茯菟。茯苓味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾和中，具有宁心安神之功效[2]。茯苓多糖(pachyman)是茯苓的主要活性成分，含量可达茯苓干重的84%，具有抗肿瘤[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗衰老[6]和增强免疫力[7]作用。茯苓多糖经化学修饰后能增强其生物学活性[8-9]。

目前，茯苓多糖对人类和畜禽动物的影响及其机制研究得较多，而在水产养殖上的研究报道较少[10-11]。本试验研究茯苓多糖对点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)非特异性免疫力的影响，为茯苓多糖在水产饲料中的应用提供参考。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

健康点带石斑鱼幼鱼由天津市海发珍品实业有限公司提供。茯苓多糖购自山东圣旺药业股份有限公司，多糖含量50%。

1.2 试验设计及方法

在基础饵料中分别添加0、50、200、350、500 mg/kg的茯苓多糖，制成5种试验饵料。基础饵料配方和营养水平见表1，复合维生素和复合矿物质按暖水性鱼类营养需求添加[12]。各原料粉碎后过60目筛，逐级扩大法混合均匀，揉成面团后用绞肉机挤成直径2 mm的面条，风干后搓碎，-18℃保存备用。将驯化1周后的点带石斑鱼幼鱼[(83.25±8.94)g]随机分配到30个水族箱（860 mm×620 mm×455 mm）中，每箱30尾。每种饵料投喂6箱。每种饵料每7 d尾静脉采血1次，每次取3箱，每箱15尾，采血前停食1 d。测定血液中的非特异性免疫指标。

试验鱼采用微流水(3.6 L/min)养殖。试验期间水质条件：水温26～28℃，盐度28～30，溶解氧＞5.6 mg/l，-N＜1.1 mg/l，NO2-N＜0.3 mg/l。日换水3次，换水时清除粪便。日投饵2次，每次饱食投喂。

1.3 测定指标及测定方法

试验鱼用MS-222麻醉后，用一次性无菌注射器尾柄采血，一部分置离心管中离心得血清，-86℃保存，另一部分用肝素钠抗凝，计数血液中的白细胞数和白细胞吞噬能力。测定血清中酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、溶菌酶(lysozyme,LZM)活力，总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,A)含量，补体C3和C4含量。ACP、TP和A均用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。白蛋白/球蛋白（A/G）=A/(TP-A)[13]。

表1 基础饵料配方（%）

1.3.1 LZM的测定

将活化后的溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）用PBS（pH值6.4）调浓度为OD570≈0.3，取150 L菌悬液均匀涂布在固体培养基上。在培养基上等间距放置直径4.32 mm灭菌滤纸片，向滤纸片中心滴加浓度分别为375、750、1 125、1 500、1 875、2 250 U/ml的溶菌酶标准品溶液10 μl，置28℃培养箱中倒置培养12 h后测量抑菌圈直径。以抑菌圈直径为X值，溶菌酶标准品浓度的对数为Y值求回归方程。取10 μl血浆加在滤纸片上，按上述方法孵育，测量抑菌圈直径。将抑菌圈直径代入回归方程，算出血浆中溶菌酶活力。

1.3.2 血液白细胞计数

抗凝血用白细胞稀释液稀释100倍后，在显微镜下用血球计数板计数。白细胞稀释液配制：98 ml蒸馏水加入1%亚甲蓝3滴、冰醋酸2 ml，配制成100 ml白细胞稀释液。血液白细胞数(个/L)=5个大方格中白细胞数×50 000×1 000×稀释倍数。

1.3.3 血液白细胞吞噬能力

在200 μl抗凝血中加50 μl浓度为4×107cfu/ml枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液，混匀后28℃孵育30 min，每10 min摇匀1次。孵育结束后涂血涂片，吉姆萨染液染色后油镜下每尾鱼计数100个白细胞吞噬情况。按下列公式计算吞噬率（PR）和吞噬指数（PI）。

吞噬率（%）=（吞噬枯草芽孢杆菌的白细胞数/白细胞数）×100；

吞噬指数=被吞噬的枯草芽孢杆菌数／吞噬枯草芽孢杆菌的白细胞数。

1.4 数据统计

试验数据用“平均数±标准误”表示，数据用Excel和SPSS13.0软件处理，做单因素方差分析，若差异显著(P＜0.05)时用Duncan's法作多重比较。表中数据用平均值±标准误表示（n=5）。

2 结果与分析

2.1 血清ACP活力（见表2）

茯苓多糖对点带石斑鱼血清中ACP活力影响不明显，仅50 mg/kg组在喂食21 d后显著高于对照组。

表2 点带石斑鱼血清ACP活力(U/100 ml)

2.2 血清A/G值（见表3）

试验组饲喂茯苓多糖14 d A/G值低于对照组，除50 mg/kg组与对照组相比差异不显著外，其它组与对照组相比差异均显著。饲喂茯苓多糖7 d、21 d和28 d血清A/G值与对照组相比差异不显著。

表3 点带石斑鱼血清A/G值

2.3 血清补体C3和C4含量（见表4）

饲喂茯苓多糖能提高补体C3含量，50 mg/kg组在第21 d显著高于对照组，200 mg/kg组在第21 d、28 d显著高于对照组，350 mg/kg组在第14 d、28 d显著高于对照组。500 mg/kg组在饲喂28 d内与对照组差异不显著。茯苓多糖对补体C4含量影响不明显，仅200 mg/kg组在第21 d显著高于对照组。

表4 点带石斑鱼血清中补体C3、C4含量(g/l)

2.4 血清LZM活力（见图1）

茯苓多糖对点带石斑鱼血清LZM活力影响不显著（P＞0.05）。

图1 茯苓多糖对点带石斑鱼血清LZM的影响

2.5 血液白细胞数（见表5）

表5 茯苓多糖对点带石斑鱼血液白细胞数的影响(×1011个/ml)

饲喂茯苓多糖7 d能提高血液白细胞数，50、200和500 mg/kg组白细胞数显著高于对照组。50 mg/kg组白细胞数在第14 d显著高于对照组。在第21 d、28 d茯苓多糖对白细胞数影响不显著。

2.6 血液白细胞吞噬能力（见表6）

茯苓多糖能提高血液白细胞PR，其中50 mg/kg组在第21 d、28 d PR显著高于对照组，200 mg/kg组在第7 d显著高于对照组，350 mg/kg组在第21 d、28 d显著高于对照组。茯苓多糖能降低血液白细胞PI，各组PI在第7 d、21 d均显著低于对照组。

表6 茯苓多糖对点带石斑鱼血液白细胞吞噬能力的影响

3 结论

饲喂茯苓多糖能降低点带石斑鱼血清A/G值、提高血清补体C3含量、提高血液白细胞数和白细胞PR，茯苓多糖对血清ACP活力、LZM活力和补体C4含量影响不明显，但能降低血液白细胞PI。建议点带石斑鱼饲料中茯苓多糖添加量为50～200 mg/kg，连续喂食28 d。

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