双链RNA的免疫调节作用及聚肌胞抗病毒应用进展

李 毅，金 一，孙伦泉，汪 明

(1.中国农业大学 动物医学院，北京 100193;2.University of Technology Sydney，Sydney，Australia)

病毒，特别是RNA病毒，侵入机体细胞后形成双链RNA(dsRNA)，能够被机体内的各种dsRNA受体识别，并通过不同的信号途径诱导机体和细胞产生I型干扰素、各种炎性因子和促炎因子，激活巨噬细胞、树突状细胞(DCs)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)等多种免疫效应细胞，使机体产生抗病毒和抗肿瘤的效果。聚肌胞(Poly I∶C)是一种人工合成的dsRNA，具有dsRNA的结构特性，目前Poly I∶C作为天然dsRNA的拟似物被广泛的用于各种研究，特别是抗病毒和抗肿瘤的研究中。本文将就dsRNA诱导机体非特异性免疫调节及利用Poly I∶C抗病毒的最新应用做一综述。

1 dsRNA刺激机体产生非特异免疫的信号通路

细胞膜表面和胞浆中有多种识别受体能够识别dsRNA，因此，dsRNA在细胞内能够通过不同细胞信号途径激活机体的非特异性免疫。其中最重要的是TLR3和RNA解旋酶RIG-I/MDA5，这两种dsRNA的受体在细胞内有不同的定位、配体特异性和下游信号途径。

1.1 TLR3 信号途径

TLR3在机体内分布广泛，在各种细胞中均有表达。免疫细胞中能够表达TLR3并诱发非特异性免疫的细胞有DCs、巨噬细胞、NK细胞和肥大细胞[1-3]。最近的研究表明，TLR3还在直接参与获得性免疫反应的T淋巴细胞中表达[4-5]。在不同的细胞中，TLR3的定位各不相同。在包括树突状细胞和巨噬细胞的大部分细胞中，TLR3主要分布在细胞内[6-7]。但在人成纤维细胞(如MRC-5细胞系)中，TLR3位于细胞表面，用抗TLR3的单抗将其封闭后，Poly I∶C不能刺激其产生INF-β。TLR3在不同细胞中的定位，可能与该细胞通过TLR3途径产生IFNs而具有不同的抗病毒特性有关。

TLR3的结构和其他TLRs一样，属于Ⅰ型跨膜受体蛋白，包括一个含有多个亮氨酸重复序列(LRRs)的胞外域，一个跨膜区和一个含有TIR保守域的胞浆尾。TLR3的胞外域是与配体结合的部位，由23个串联排列的LRRs组成，形成一个马蹄形的螺旋结构[8-9]。最近的研究表明，TLR3与dsRNA的结合位点是胞外域上无聚糖的LRR20。TLR3与dsRNA结合时，两分子的TLR3聚合成双体，并且其中的一个翻180°，分别与dsRNA的两条链结合。胞外域的糖基化情况和配体的结构特性都能够影响TLR3结合dsRNA，如更长的Poly I∶C双链能够更有力的促进TLR3的下游信号，这可能是更长的dsRNA能够与多个TLR分子结合，介导TLR3的多聚化[10]。目前对于TLR3识别Poly I∶C并且将其转运至细胞内的机制尚不够明确。最近Lee等[11]发现CD14与TLR3在细胞内的内质网和高尔基体上的共定位，一旦Poly I∶C被内化后，CD14能够直接与Poly I∶C结合，并与TLR3共定位于内涵体和溶酶体上，CD14将Poly I∶C传递给TLR3后启动下游信号途径。

TIR域由5个α-螺旋包围的5个β-折叠组成，这两个二级结构由BB环(α-螺旋B连接β-链B)所连接，BB环能够与TLR接头分子相互作用。与其他TLRs的BB环都含有保守的脯氨酸残基不同，TLR3上BB环的脯氨酸残基被丙氨酸所取代，这使得TLR3成为唯一不需要MyD88辅助而直接能与TRIF结合的TLR[3]。当TIR与细胞中TRIF结合后，通过不同的途径间接活化多种转录因子如 NF-κB和 IRF3。TRIF是细胞中的TIR结合蛋白，在Poly I∶C通过TLR3途径激活非特异性免疫过程中是必须的因子，Poly I∶C无法使TRIF敲除小鼠产生免疫反应。RIP1和TAK1在Poly I∶C激活NF-κB的途径中具有重要的作用，缺少这两者中的任何一个，都会阻断Poly I∶C对NF-κB的活化。TRIF还能够与TRAF3和NAP1结合，其中TRAF3的功能尚不明确，但是在TRAF3缺失的细胞中，TLR3不能刺激IFN-β的生成。NAP1是IKK相关激酶IKKε和TBK1(TANK结合蛋白，也称为NF-κB活化蛋白NAK)的结合蛋白，并且也是IKKε/TBK1激酶复合物上的亚单位。IKKε/TBK1磷酸化IRF3，使其结合成二聚体并将其转运至细胞核内，调控相关基因的转录[12]。

1.2 RIG-I/MDA5 信号途径

从TLR3缺陷小鼠分离到的成纤维细胞和cDC细胞经细胞内给以Poly I∶C，或是被仙台病毒、新城疫病毒或VSV感染后同样能够产生INF-β，说明细胞内除了TLR3外，还有其他的受体能够与外源性的Poly I∶C或者是病毒产生的dsRNA结合，并经一系列的信号途径传导后激活NF-κB和IRF3。RIG-I/MDA5就是除TLR3外识别dsRNA最重要的受体之一。

RIG-I/MDA5位于细胞浆内，属于DExD/H box RNA解旋酶，含有两个天冬酰胺富集域样的结构域(CARD-like结构域)，这与RIG-I诱导的下游信号途径有关，其中MDA5还含有一个单一的解旋酶结构域[13]。

IPS-1是RIG-I/MDA5的下游受体分子，其一头含有CARD结构域，另一头嵌在线粒体的双层膜中。RIG-I/MDA5识别了外源性的Poly I∶C或者是病毒产生的dsRNA后形成起始信号，IPS-1上的CARD结构域与RIG-I/MDA5结合后，活化TBK1/IKKi，磷酸化后的TBK1/IKKi能够活化IRF3和IRF7，后者形成二聚体并转运至细胞核内，促进相关细胞因子的表达[14]。

2 Poly I∶C对非特异性免疫的调节作用

2.1 促进干扰素及其他细胞因子的产生

当NF-κB和IRF-3活化后，能够引起细胞内各种炎性因子和趋化因子的表达增加，其中最重要的是IFN-α/β，此外还有 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10等。但是在不同的细胞内，Poly I∶C刺激细胞产生的细胞因子有差别，且具有种属特异性。体外实验表明，Poly I∶C能够刺激人的非骨髓样细胞如内皮细胞和滑液囊成纤维细胞(RA-SFs)产生IL-6和TNF-α等炎性因子。但在正常的人DCs和巨噬细胞中，Poly I∶C不能够通过TLR-3活化 NF-κB、IRF-3和 MARKs，因此不能使正常的这两类细胞产生TNF-α、IL-6和IL-8，而Poly I∶C却能够刺激小鼠的DCs产生TNF-α和IL-6[15]。产生这种现象可能是由于不同的细胞中信号转导通路中含有不同的信号分子，或者是不同细胞中的表达调控分子不同，而且，每种细胞在免疫反应中的作用也不一样。

2.2 活化DCs和NK细胞

骨髓树突状细胞(mDC)是一种专业的抗原呈递细胞，而且能够与CD8+T细胞之间发生交叉呈递作用，在机体抗病毒机制中具有重要作用。DCs细胞膜表面具有TRL3分子，Poly I∶C被mDC细胞膜上的TLR3识别后不但能够产生I型干扰素，而且通过IFN-α/β所介导的信号途径促进DCs的成熟，提高了其作为专业抗原呈递细胞呈递抗原的能力，在抗病毒和抗肿瘤过程中发挥了重要的作用。Poly I∶C还能够刺激 DCs上调表达 HLA-DR、CD80、CD86、CD83，刺激 CTL和NK细胞的成熟。

NK细胞是机体抗病毒和抗肿瘤免疫的主要效应细胞，Poly I∶C与TLR3结合后，可以通过以下三条途径激活NK细胞:①体外实验发现，Poly I∶C与TLR3结合后，经TICAM-1途径活化 mDC细胞表面的分子如 IFN-γ、IL-12或 TNF-α等，通过mDC与NK细胞的直接接触而活化NK细胞，这可能是mDC活化NK细胞的主要途径，但是目前对这一途径的体内机理还不完全清楚;②mDC不与NK细胞直接接触，而是通过向细胞外释放I型IFN或其他细胞因子而激活周围的NK细胞。这两条途径表明，TICAM-1是Poly I∶C诱导NK细胞杀伤肿瘤的重要因子[16]。③Poly I∶C不通过TLR3-TICAM-1途径，而是可能通过启动细胞质中的dsRNA受体MDA5，启动RIG-I/MDA5信号途径转录I型IFN而激活NK细胞。因为在TICAM-1-/-小鼠接受Poly I∶C刺激后，仍然可以观察到NK细胞被激活。

2.3 促进细胞凋亡

细胞凋亡是机体抵抗微生物感染和肿瘤扩散的一种重要的自我保护机制。最近的研究发现，dsRNA能够通过多种途径诱导肿瘤细胞的凋亡，如在胰腺β细胞中诱导PKR和caspase信号途径导致细胞凋亡，而在上皮细胞中则主要是通过诱导caspase信号途径诱导细胞凋亡[17-19]。Poly I∶C能够通过与TLR3结合后，诱导细胞产生I型干扰素，活化NF-κB p65和caspase导致肿瘤细胞凋亡，TLR-3的下游信号分子IL-1受体相关激酶-4(IRAK-4)和IFN-β可能在其中具有重要作用[20-21]，但是其具体的机理尚不明确。

3 Poly I∶C的衍生物及其抗病毒应用

Poly I∶C具有双链RNA的结构，能够模拟病毒感染后所形成的dsRNA，刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应，具有良好的抗病毒作用，是一种广谱的抗病毒剂，在体内对黄热病毒、西方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、裂谷热病毒和狂犬病毒都有抑制作用。但是将Poly I∶C直接作为药物应用于临床时，会对身体产生一定的毒性，如导致发热，血凝异常，肝脏酶的轻微增高等，且和给药量成正比。为了降低其对机体的毒性，并提高Poly I∶C刺激机体产生干扰素的能力，人们对其进行了改造，创造出了多种Poly I∶C的衍生物。

将Poly I∶C与聚左旋赖氨酸混合后溶于羧甲基纤维素形成的复合物(PolyICLC)便是其中之一。PolyICLC在小鼠体内诱发的IFN最高浓度比Poly I∶C高5～8倍[22]。Wong等[23]的研究表明，PolyICLC在小鼠体内具有抗流感病毒(H1N1)的作用，且对接受致死剂量病毒感染的小鼠具有100%的保护率。但是，PolyICLC同样会对机体产生一定的毒性，如使动物的体重降低，体温降低，造成肺动脉栓塞和肝坏死，导致血清中的鸟苷酸羰基转移酶、血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平升高。使用脂质体包被PolyICLC后，形成的Liposome-PolyICLC能够显著的降低PolyICLC的副作用[24]，其抗流感病毒保护期能够从12 d提高到21 d，且对高致病性禽流感病毒(H5N1)也有抑制活性[25]。Lau等[26]利用 PIKA(一种脂质体包被的PolyICLC)作为预防和治疗药物，能够有效抑制A型流感病毒在小鼠体内的增殖，且能提高灭活流感疫苗的免疫保护，这种作用与PIKA能够通过TLR3途径激活机体的先天免疫有关。

PolyIC∶MPC 和 PolyIC∶PolyC12U 是 Poly I∶C 的另两种衍生物。Poly IC∶MPC是将Poly I∶C胞嘧啶碱基上的5'巯基化后形成部分巯基化双链RNA[27]。研究表明，7.5%巯基化是刺激机体产生IFN-α/β、IFN-γ，活化巨噬细胞和NK细胞，并具有最佳抗病毒和抗肿瘤效果的最佳比例[28]。PolyIC∶MPC对小鼠，兔以及豚鼠的毒性很小，且比Poly I∶C更能耐受血清中核糖核酸酶的降解[29]。

美国Hemispherx生物制药公司发明的Ampligen(PolyI∶PolyC12U)是一种错配的双链RNA，能够上调或下调2，5-腺苷酸合成酶/RNaseL(2-5A synthetase/RNase L)系统和P68蛋白激酶系统，且这种作用不依赖于干扰素。RNase-L通路是参与病毒感染免疫反应的一个系统，称为细胞内免疫。PolyI∶PolyC12U激活2-5A合成酶，活化的2-5A合成酶再激活RNase-L，而RNase-L可以破坏病毒RNA。2-5A合成酶还能够抑制反转录酶，因此PolyI∶PolyC12U可以被用来抑制HIV和HBV的增殖。PolyI∶PolyC12U可以诱导p68激酶的自身磷酸化，通过另外两个因子elF2a和elf25-P抑制病毒蛋白合成。Ampligen对肝炎病毒有良好的抑制效果，并已获得FDA授予的罕用药资格，在治疗慢性疲劳综合征和艾滋病方面已分别进入Ⅲ期和Ⅱ期临床研究[30]。

4 结语

先天免疫在抗病毒过程中具有重要的作用。Poly I∶C作为先天免疫的刺激剂，激发抗病毒因子作用迅速，且能够避免化学药物和疫苗由于病毒变异而产生的耐药性，对于抗病毒治疗具有一定的优势，目前在临床上可用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎、带状疱疹、各种疣类和呼吸道感染等。但由于对机体存在一定毒副作用，因此还需要进行改进:一是进一步对dsRNA双链分子的改造或修饰，使之更加容易被细胞上的受体识别，发挥更大的免疫刺激作用，降低对机体的毒副作用;二是由于合成技术的限制，这类药物的合成以及脂质体包被的成本较高，价格比较昂贵，因此需要研究更加经济的合成工艺和剂型设计，提高缓释效果，降低其毒副作用，增加其临床应用价值。

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