脂肪干细胞应用于脂肪移植的新进展

罗旋 综述 王琳 范志宏 审校

脂肪干细胞应用于脂肪移植的新进展

罗旋 综述 王琳 范志宏 审校

脂肪干细胞（Adipose derived stem cells，ADSC）具有多向分化和自我复制能力，逐渐成为损伤修复及再生医学研究的热点。ADSC能够分化为脂肪细胞以及血管内皮细胞，可分泌细胞因子，促进血管新生，改善炎症损伤的微环境，并抑制细胞凋亡。在脂肪移植中应用脂肪干细胞，可以明显降低移植后脂肪组织的液化吸收，减少不良反应发生率，提高远期疗效。

脂肪干细胞脂肪移植血管新生微环境

自体脂肪组织作为软组织填充物不发生免疫排斥反应，并且质地自然、获取容易，然而脂肪细胞液化吸收、组织纤维囊形成等问题一直未能解决。以往的研究主要采用优化手术操作技巧、增加漂洗、低温保护等措施，以降低脂肪组织的损伤，但没能从根本上解决移植物损伤严重、存活困难的问题。脂肪干细胞的引入，给脂肪移植后的组织存活带来革命性的改进。由于具有自我复制能力和多向分化潜能，能分泌多种细胞因子和生长因子，脂肪干细胞添加到移植物中，大大提高了脂肪细胞移植后的存活率，降低了坏死、液化、纤维化、钙化等不良反应的发生率。

吸脂术的出现使大量脂肪组织的获得成为可能，然而负压吸引和机械损伤使成熟脂肪细胞破裂和坏死明显增加，并且抽吸出的脂肪组织相比切取的脂肪组织，缺少了结缔组织、血管等成份，其脂肪干细胞的获得量是切取脂肪组织获得量的一半[1]。大量脂肪干细胞留在供区，只有少数脂肪干细胞随成熟脂肪细胞团块被注射到受区。Matsumoto等把同一供者来源的脂肪抽吸物与切取的完整脂肪组织相比较，抽吸物中的脂肪干细胞数较切取的脂肪组织中少（48±13）%。另有学者将添加了脂肪干细胞的颗粒脂肪和单纯颗粒脂肪，分别注射到免疫缺陷小鼠皮下，4周后，添加脂肪干细胞组的移植物体积比单纯颗粒脂肪移植组平均高35%，且移植后组织中血管密度显著增加[2]。基于以上结果可知，吸脂术中得来的脂肪因缺乏完整脂肪组织中的干细胞及基质成分，难以在移植后长期存活。Yoshimura等利用富含脂肪干细胞的基质血管成份（Stromal vascular fraction，SVF）添加到移植的脂肪组织中，提高了移植物中干细胞的比例，称为细胞辅助的脂肪移植（Cell assisted lipo-transfer，CAL）。在自体脂肪移植隆乳术中，初始注射脂肪体积平均270 mL，两个月时为100～200 mL；40名受试者中除4人出现纤维囊或钙化形成，绝大多数人对手术结果很满意[3]。该结果揭示了脂肪干细胞在颗粒脂肪移植中的应用前景。

1 脂肪干细胞的表型特征

目前，脂肪干细胞的分离、富集多是采取胶原酶消化皮下脂肪，获得一个混杂的细胞群体——SVF，再利用细胞表面分子分选，或通过体外培养传代，获得较纯的脂肪干细胞[4]。因此，对细胞的表型分析可用于脂肪干细胞的纯化和鉴定。

目前还没有一个单一的分子能够作为脂肪干细胞的特异性表型，公认的脂肪干细胞表面表达量较高的分子有：基质相关标志（CD29、CD44），间充质标志（CD73、CD90）等[5]，而SVF中混杂的其他细胞标志，如血管内皮细胞（CD31）、管壁细胞（CD140）、单核细胞（CD14）、巨噬细胞（CD11）、造血细胞（CD45）、红细胞（Ter119）、淋巴细胞（CD3、CD4、CD8、CD19）等均呈阴性表达[6-10]。

分离的原代脂肪干细胞，经体外培养传代3次后，表型会有所变化。CD34是一种黏附分子，在介导细胞间黏附时发挥重要作用，还参与造血干细胞的运输、定植，参与炎症反应及淋巴细胞的归巢，被认为是干细胞和祖细胞多向分化潜能的标志之一。在未经体外培养的脂肪干细胞表面高表达，传代3次后表达消失，然而CD34的表达与否对脂肪干细胞的分化活性没有影响[9-14]。CD105是一种内皮糖蛋白，也被视为多向分化潜能的标志，其表达随着体外培养传代次数的增加而逐渐上调[15]。

另外，脂肪干细胞表面还发现了一些分子，虽不像上述分子表达量高，但反映了脂肪干细胞的间充质来源和其在组织中基质血管旁的定位。这些分子包括：间充质标志（CD10、CD13）[5，11]，细胞间黏附分子（CD54），血管细胞黏附分子（CD59、CD146）[6]，白细胞活化黏附因子（纤连蛋白、内皮粘液素、平滑肌特异性α肌动蛋白、钙调蛋白、钙结合蛋白、波形蛋白等[16]）。极少数（＜10%）脂肪干细胞表达STRO-1[10]。

2 脂肪干细胞在脂肪游离移植中的作用。

2.1 脂肪干细胞分化为脂肪细胞，维持移植物的体积

脂肪干细胞分化为体积较大的成熟脂肪细胞，补充移植过程中损伤坏死的脂肪细胞，是维持移植物体积、保证移植后长期疗效的关键。应用激素、细胞因子等诱导脂肪干细胞向脂肪细胞分化已经实现。在脂肪干细胞中，CD24+的细胞被证明有较高的成脂分化能力[8]；体内试验中，脂肪干细胞复合海绵状胶原能在裸鼠体内，经8周时间形成脂肪样组织[17]。向脂肪细胞分化的脂肪干细胞表达脂蛋白脂肪酶、转录因子aP2、过氧化物酶体增殖激活性受体-γ（Peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）和葡萄糖转运蛋白4（Glucose transporter protein 4，Glut4）等脂肪细胞相关基因[18]。其他影响内环境的因素，如内外源性的生长因子、氧分压、pH值、细胞外基质中的黏附分子、相邻细胞的作用、生物力学因素等，都会作用于细胞，使之增殖或改变其分化能力。可以确定能促进脂肪干细胞成脂分化的因素有：糖皮质激素、生长激素、胰岛素、前列腺素、甲状腺激素、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等，而表皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）则抑制成脂分化。

2.2 脂肪干细胞促进血管结构的生成，增加移植物血供

成熟的脂肪细胞对缺血、缺氧很敏感，在氧分压较低的环境中很容易发生一系列应激性改变，如吐出胞质中的脂滴、细胞体积逐渐缩小；并且当氧分压低于所能耐受的阈值?时，24 h内就会死亡。然而，移植后受区基底组织中的毛细血管长入需要7 d时间[19]，因此尽早建立血供才能减少移植后组织细胞凋亡，维持移植物的体积[20]。

脂肪组织生长时，血管生成也很活跃，且是最先开始的，抑制血管生成将会导致脂肪组织萎缩[9]。脂肪干细胞参与血管构建过程，已被多次证实[9，11，21-23]：Borges等将人的脂肪干细胞和血管内皮细胞共同移植，能有效构建鸡的绒毛尿囊膜的微血管网络，肯定了脂肪干细胞促进血管生成的作用[20]；添加了成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）的脂肪干细胞注入鼠缺血后肢肌肉间隙，能使之耐受缺氧并保护周边的细胞，使其在缺氧环境中减少损伤，明显提高毛细血管血液灌流和缺血肌肉的存活率；还有研究表明，在随意皮瓣缺血损伤动物模型中，脂肪干细胞的注入可以使皮瓣毛细血管密度增加，血液灌流增加，成活率提高[9，24]；Ebrahimian等[25]的皮肤创伤修复研究中，脂肪干细胞的应用提高了创伤后皮肤血液灌流以及毛细血管密度。

2.2.1 脂肪干细胞分化为血管内皮细胞，形成血管结构

Amos等[26]的实验表明，未分化的脂肪干细胞不表达任何内皮细胞表面标志，接种于基质上培养会呈现类似血管内皮细胞形态的多角形。在内皮细胞生长添加剂（Endothelial cell growth supplement，ECGS）和生物剪切力的协同作用下，脂肪干细胞重新排列，摄取乙酰化低密度脂蛋白（acLDL），表达血管内皮细胞表面标志CD31和血管干细胞相关分子，如血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor-BB，PDGFBB）、血管内皮生长因子165（Vascular endothelial growth factor-165，VEGF-165）；还表达周细胞表面标志，如平滑肌α肌动蛋白、神经胶质细胞抗原2。虽然未能检测到表达一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase，eNOS）、血管假性血友病因子（Von Willebrand factor，vWF）[25，27]，但足以说明脂肪干细胞经过一定的环境诱导可以向内皮细胞分化。

2.2.2 脂肪干细胞通过旁分泌作用促进血管新生

大多数脂肪干细胞注入受区后定位于毛细血管周围，而不是参与其构成；脂肪干细胞和血管内皮细胞共培养时可见脂肪干细胞聚集在血管周围，紧贴血管壁，同时血管伸出新芽，联结成网络结构的能力明显增强[5]；脂肪干细胞的条件培养液使体外培养的毛细血管内皮细胞存活率从50%提高到100%。以上现象提示，未分化的脂肪干细胞在促进血管新生和稳定血管结构的过程中，主要以旁分泌形式发挥作用[12，28-29]。脂肪干细胞本身就能较高水平地分泌血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β），少量分泌粒细胞-巨噬细胞集落细胞刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）等促进血管生成、抗凋亡的生长因子。在缺氧的环境中，脂肪干细胞被激活而分泌更多的VEGF[9]，发挥抗缺血、抗炎修复功能。脂肪干细胞还可以分泌胰岛素样生长因子-1（Insulin like growth factor-1，IGF-1）[30]，除能抑制细胞凋亡[5]，还有动员内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）等作用[31]，促进血管生成。脂肪干细胞分泌的其他活性因子也具有抗炎修复能力，包括炎症因子：IL-6、IL-8、IL-11、IL-17；细胞趋化因子：单核细胞趋化蛋白1和2、巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，MCSF）等[5]，对血管生成起着辅助的协同作用。

2.3 脂肪干细胞调节受损组织局部微环境

脂肪细胞在移植到受区后几个月内就会死亡，由新生的脂肪细胞取代，所以建立有利于组织生存的微环境对于移植后的修复和重建至关重要。脂肪干细胞可以分泌一系列细胞因子和生长因子到周围组织液中，调节组织微环境，形成有利于干细胞生长的微环境——“干细胞巢”，招募来自于受体的内源性干细胞到达靶点，并使其向所需要的特定组织细胞定向分化。脂肪干细胞本身能够耐受缺氧，同时在缺氧的环境中还能释放抗氧化物质、自由基清除剂、分子伴侣、热休克蛋白等，清除受损局部的细胞毒性物质，促进尚存活的细胞复苏，在脂肪移植后形成有利于组织细胞存活和功能维持的微环境[4]。

3 脂肪干细胞应用于颗粒脂肪移植技术中的发展及展望

在颗粒脂肪移植技术中添加脂肪干细胞，能够明显减少脂肪液化吸收，改善长期效果。首先，脂肪干细胞能够分化为脂肪细胞，补充因损伤而减少的脂肪细胞数量；其次，脂肪干细胞分化为血管内皮细胞，通过旁分泌促进血管新生，促进血供恢复；此外，脂肪干细胞通过旁分泌作用，调整组织局部微环境，减少细胞损伤，提高移植后组织细胞存活率，使得脂肪游离移植的长期效果更稳定。

虽然已有早期的临床实验初步证明，在颗粒脂肪移植中添加脂肪干细胞可以有效提高成活率，改善不良反应，提高长期效果[3]。然而，移植物中干细胞与脂肪组织的最佳比例及脂肪细胞与脂肪干细胞之间的相互作用和转归等，还有待进一步研究。

相比SVF，传代培养的脂肪干细胞抗原性减弱，当与异体外周单核细胞共培养时，不会刺激混合淋巴细胞反应，提示脂肪干细胞在体内不会引起细胞毒T细胞反应[13，32-33]，即脂肪干细胞有一定的免疫抑制能力，然而脂肪干细胞在临床实践中是否能够用于同种异体移植，以及长期应用是否具有成瘤性等安全问题，还有待更多更深入的研究来进一步验证[4]。

在机体生长发育到衰老过程中，干细胞的数目逐渐减少，多向分化的活性逐渐减弱[34]，所以，如同建立脐带血干细胞库一样，建立脂肪干细胞库，及时将脂肪干细胞保存起来，可能是再生医学今后发展的趋势。

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Application of Adipose Derived Stem Cells in Autologous Fat Transplantation

Adipose derived stem cells;Autologous lipo-transfer;Angiogenesis;Microenvironment

R622+.9

B

1673－0364（2011）03－0171－04

LUO Xuan,WANG Lin,FAN Zhihong.
Department of Plastic Surgery,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China. Corresponding author：FAN Zhihong(E-mail：renji_plastic@vip.163.com).

2011年2月3日，

2011年3月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.015

200127上海市上海交通大学医学院附属仁济医院整形外科。

范志宏（E-mail：renji_plastic@vip.163.com）。

【Summary】Adipose derived stem cells(ADSC)is an ideal source for regenerative medicine and tissue engineering,owing to its multipotential differentiation and self-replicating ability.ADSC can differentiate into fat cells and vascular endothelial cells.It can secrete cell factors,promote angiogenesis,improve the environment of inflammatory lesions,and inhibit cell apoptosis.Application of ADSC in autologous lipo-transfer has the advantages:reduction of the liquefaction and absorption of adipose tissue after transplantation,minimal adverse reactions,and long-term outcomes.