磷脂酶A2在重症急性胰腺炎中作用的现代认识

张爱群 黄志强

磷脂酶A2在重症急性胰腺炎中作用的现代认识

张爱群 黄志强

急性胰腺炎(AP)是消化系统常见急腹症，临床病情轻重不一，多数情况下为轻度自限性疾病，部分病例病情变化急剧，伴有系统性炎症反应综合征(SIRS)并可进展至多器官衰竭，病死率高。目前临床缺少早期预测病情进展的血清学指标，也无针对过度炎性应答和器官损伤的特效治疗药物，因此迫切需要从不同角度深化对重症AP(SAP)病理生理过程中关键分子作用的认识。一般认为，胰酶原位异常激活致胰腺组织自身消化是AP发病的始动环节，众多胰酶及病变胰腺局部产生的炎性介质吸收入血诱发系统效应和远处脏器损伤是SAP特征性病理生理事件。在胰腺相关水解酶中，磷脂酶A2(PLA2)功能独特，它不仅水解细胞膜质脂骨架成分，改变膜理化性状，并且其产物花生四烯酸(AA)和溶血卵磷脂可分别引发小分子活性介质(如TXA2、白三烯、血小板活化因子等)生成和细胞膜崩解，据此推测PLA2在AP的局部和系统表现中发挥着重要作用。本文系统介绍PLA2结构特点、体内分布、生理功能及在AP发生发展中的变化，探讨其预测AP病情和作为干预靶点的可能性。

一、PLA2及其受体的分类和分布

PLA2水解磷脂分子上的sn-2酯键，生成脂肪酸和溶血磷脂。根据生化特性和分布将其分为分泌型(sPLA2)、胞质型(cPLA2)、胞内钙非依赖型(iPLA2)等亚型。sPLA2的基因产物IB最早被克隆，因在胰腺中高表达，故也称之为胰腺型PLA2。它以酶原形式由胰腺腺泡合成，经胰管排至十二指肠肠腔，经胰蛋白酶水解后活化。第二个被克隆的基因产物ⅡA也称炎症型sPLA2，它以活性形式分泌。现累计发现10种人类sPLA2基因产物[1]，即ⅠB、ⅡA、ⅡD、ⅡE、ⅡF、Ⅲ、Ⅴ、Ⅹ、XⅡA及XⅡB，后者是一种缺乏酶活性的PLA2样蛋白。sPLA2为分子量约14 000 的小肽，含有5～8个分子内二硫键、一个高保守的酶活性中心和一个Ca2+结合环。sPLA2在自然界广泛存在，除哺乳动物组织和蛇毒外，还见于其他爬虫毒液及无脊椎动物、真菌、细菌、病毒及植物体内。

sPLA2种类及其分布具有明显的种属差异，如小鼠体内Ⅴ较ⅡA占优势，其表达受内毒素诱导，而大鼠遇同样刺激则大量分泌ⅡA，表现为心、肺、脾、小肠及睾丸等器官高表达，但Ⅴ仅局限在心脏。在人体组织细胞中，ⅠB主要在胰腺表达，ⅡA广泛分布在心、肝、肺、骨骼肌、结肠、小肠、卵巢及前列腺等组织，而Ⅴ在心脏呈强表达，Ⅹ在脾脏、胸腺和外周血白细胞中表达[2]。此外，sPLA2的产生还与刺激的性质有关，家族成员之间存在功能上的重叠，从而解释为何某种类型(如ⅡA)缺乏并未引起机体结构和功能的明显异常。

体内尚存在sPLA2的特异结合蛋白，故sPLA2可通过酶活性和特异结合蛋白(受体)两条途径发挥生物学作用。蛇毒sPLA2主要有M型和N型两种sPLA2受体，分别介导蛇毒sPLA2的肌肉和神经毒性。哺乳动物M型受体为一分子量为180 000的单链蛋白，能高亲和地与哺乳动物来源的ⅠB、ⅡA结合，而N型受体不能结合。ⅠB与M型受体结合在不同细胞可引起多种生物学效应，其中包括细胞的增殖、迁移、收缩以及AA类的生成，并且该受体还参与sPLA2的清除过程[3]。M型受体还有一种可溶形式，其分子结构中缺少跨膜和胞内部分，与ⅡA结合后抑制后者的催化活性，提示该受体为ⅡA的天然抑制分子。巧合的是，肺泡表面活性蛋白A与可溶性M型受体结构相似，也能特异结合ⅡA并抑制其活性[4]。

二、sPLA2的生理功能

不同于ⅠB主要来自胰腺外分泌腺泡上皮，ⅡA则在血小板和关节滑液中含量很高[5]。由于体内天然存在的磷脂多以聚集状态存在，因此sPLA2与其作用物的界面结合活性是PLA催化磷脂水解的前提。人ⅡA为强碱性蛋白，等电点约9.4，分子净电荷达+19，并且正电荷残基主要分布在分子表面，此特性决定了该分子能与带负电荷的磷脂膜结构形成超分子聚集体。人ⅡA的另一特点是缺少色氨酸，而分子表面的色氨酸促进蛋白与中性磷脂间发生界面结合，由此解释ⅡA对兼性离子表面亲和力很低。ⅡA借助分子表面正电荷与带负电荷的目标物结合，对后者含有的磷脂进行水解。目标物可以是入侵的细菌，特别是革兰阳性菌。对革兰阴性菌则需要杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)协助，ⅡA才能穿过细菌脂多糖外膜接触到胞膜磷脂[6]。ⅡA抗菌作用的支持证据还包括过度表达ⅡA的转基因鼠能抵抗不同类型的细菌感染[7]，反之ⅡA缺乏使小鼠对金黄色葡萄球菌感染的抵抗力下降[8]。

ⅡA对细菌胞膜磷脂的水解在白细胞存在时增强。ⅡA的抗菌作用在人类和啮齿动物都强于其他类型的sPLA2。ⅡA的体内分布特点也与其抗菌作用吻合，如ⅡA较高水平地存在于小肠黏膜的Paneth细胞、泪腺和泪液、前列腺及精液中，这些部位均通过开放性管道与外界相通，从而构成了机体先天抗感染免疫防御系统的一部分[9]。而哺乳动物细胞膜外表面呈现兼性离子状态，可抵抗感染或创伤时血清中急剧增高的ⅡA。典型例子是人泪液中ⅡA高达2 μmol/L，但未对角膜上皮细胞造成损害。相反，微量蛇毒来源的sPLA2就可快速水解哺乳动物细胞膜，区别在于蛇毒sPLA2能有效地结合到胞膜的兼性外表面，接触膜磷脂并促其水解。有研究表明，ⅡA释放AA的能力还与细胞活性状态有关，当膜上磷脂爬行酶(scramblase)将带负电的ⅡA高亲和底物由内部运至细胞外表面时，才发生ⅡA催化的膜磷脂水解[10]。此外，不同sPLA2对膜磷脂的水解活性有强弱之分，如体外给予X能使CHO-K1细胞释放AA增多，而ⅠB、ⅡA则否[11]。

ⅡA还可以通过释放AA和后续产生前列腺素等活性分子对宿主细胞产生影响，但对其作用途径及效应仍存有争议[12]。炎症或创伤时产生的细胞残骸及微粒有促炎作用，ⅡA的上述作用有利于炎症消散和结构恢复。肿瘤相关研究显示，血清中膜结构微粒含量升高预示肿瘤患者预后不良，而ⅡA高表达则相反，进一步提示ⅡA与微粒清除间有密切关联[13]。尽管ⅡA并非象早先推测的那样是一种促炎因子，但近期有研究显示它有非酶促的间接促炎活性，如能与整合素结合可诱导单核细胞增殖[14]。

三、AP时体液sPLA2含量的变化及其病理生理学意义

正常情况下血清中ⅠB含量极低，而ⅡA水平则存在着明显的种属差异，如大鼠、兔明显高于人和狒狒，而在小鼠则低至检测低限以下。正常成人血清ⅡA水平低于10 μg/L，但当发生严重感染及炎性疾病活动期，血清ⅡA则增高上千倍。Pruzanski等[15]首先报道血ⅡA水平增高与败血症休克发生相关，此后许多研究结果显示各种炎性疾病患者体液中ⅡA水平异常增高。AP患者血清PLA2活性明显升高，并且重症者高于轻症者[16]。Nevalainen等[17]报道，除在严重败血症和AP患者血清中检测到ⅡA和ⅠB外，未检出其他类型的sPLA2，并且所检测到的ⅠB为无活性酶原，且SAP患者血清sPLA2活性的升高源自ⅡA，而非ⅠB。ⅡA被认为是一种急性期反应蛋白依据以下研究结果：(1)体外培养细胞在细胞因子刺激下分泌ⅡA；(2)对志愿者实验性给予内毒素，其血清PLA2活性升高[18]；(3)血清ⅡA升高常见于包括AP在内的许多感染性疾病或炎性状态，并与血清内毒素和IL-6水平密切相关[19]。动物实验显示，血中高水平的PLA2并无明显有害作用。有人用先天性ⅡA缺陷的C57BL/6J培育人ⅡA转基因鼠，后者血清高水平的ⅡA并未伴有明显的生理功能异常，并且当给予乙硫氨酸伴无胆碱饲料诱发AP后，两种小鼠的病情严重程度也没有差别[20]。但值得注意的是，细胞在一定条件下对sPLA2反应性增强，如在内毒素或钙载体存在时，白细胞产生前列腺素和白三烯明显增多。

AP时，ⅠB由胰腺腺泡破坏而释放入血，而ⅡA可能主要由血小板和肝细胞产生。HepG2细胞在IL-1、IL-6及TNF诱导下生成ⅡA[21]，AP患者肝组织活检发现ⅡA表达增高并伴有血清ⅡA水平升高，而正常情况下肝内未检出ⅡA mRNA或蛋白[22]。从纯化的人中性粒细胞中检测出Ⅴ和Ⅹ，但未见ⅡA，而某些情况下检测到的ⅡA可能为白细胞吞噬后的残留物。

胰蛋白酶和PLA2抑制剂在AP实验动物多显示良好效果，但对人AP的治疗作用却不明显，初步应用ⅡA特异性抑制剂并未使患者预后有明显改善[23]，并且针对其上游调控因子的干预，如使用TNF-α特异性抗体，能诱发潜在感染如结核和疏螺旋体病等[24]。因此PLA2特异性抑制剂对AP的临床治疗效果仍有待临床研究证实。

四、sPLA2与胰腺及远处器官损伤

由于AP时胰腺存在明显的ALP2活性，因此推测ⅠB参与了胰腺的自身消化甚至出血坏死。然而体外研究发现，ⅠB对培养细胞的裂解作用有限，只有卵磷脂存在时，胰腺腺泡上皮细胞才发生明显破坏[25]。由于胆汁中含有卵磷脂，一旦胆汁进入胰管并伴有胰腺内ⅠB激活，则生成大量溶血卵磷脂，导致胰腺组织损伤。给豚鼠静脉输注胰腺来源的PLA2能激活AA链式反应，血浆白三烯水平升高，并出现血压、心律及血液碱剩余降低等AP常见的系统反应[26]。AP大鼠ⅠB漏入腹腔可引起该部位细菌易位[27]。尽管动物实验结果提示ⅠB参与AP病理生理过程，但AP患者血清IB为无活性形式，故从ⅠB角度无法解释人AP时的系统表现。

目前对PLA2在远处器官炎性损伤及功能不全中作用的认识有限。发生呼吸功能不全者血清PLA2活性及ⅡA水平升高，但ⅠB变化不明显，肾功能不全时也表现类似情形[28]。肺泡表面活性物质是一种脂质(占90%)和蛋白结合形成的大分子复合物，它不仅降低肺泡上皮的表面张力，而且还是机体防御系统的一部分，尤其能抑制局部某些炎性反应介质。某些病理生理状态下肺泡表面产生过多ⅡA，分解表面活性物质中的卵磷脂，削弱了对炎性介质的抑制作用，导致肺内ⅡA储积和表面活性物质不足的恶性循环。局部PLA2还通过介导炎性细胞活性因子生成促进肺损伤[29]。这些因素综合作用造成肺泡壁间隙水肿渗出，肺泡顺应性下降，加速肺功能不全的发生。SAP时肾和肝的受累呈现一定共性，又各有特点。胰蛋白酶、PLA2作用于血浆蛋白和有形成分引起高凝状态和肾血管灌流不足是导致肾脏损伤的机制之一[30]。而SAP致小肠黏膜屏障破坏和肠道内环境改变均有利于内毒素大量吸收入肝，刺激肝内Kupffer细胞持续活化，释放大量致炎因子和活性氧，直接或通过作用于白细胞、血小板和血窦内皮细胞，引起肝内微循环紊乱、炎性细胞浸润、肝细胞损伤和肝功能障碍[31]。

五、sPLA2对AP严重程度及预后判断的价值

AP患者血清PLA2活性和ⅡA水平重症明显高于轻症，并且血清ⅡA持续升高多见于胰腺坏死伴发感染的病例[32]。Hietaranta等[33]报道， AP患者入院后血清sPLA2水平逐日升高，但3 d后持续增高者见于并发SIRS者，而轻症者则在此后逐渐下降；有和无呼吸功能衰竭并发症的两组也呈现类似趋势，只是在时相上更晚些发生。然而血清ⅠB水平随时间推移逐渐下降，并且在是否发生SIRS及器官并发症的患者之间无明显差别。由于血清Ⅱ型PLA2(或ⅡA)升高见于包括AP在内的各种系统性炎性疾病，因此尚不足以作为SAP的早期预测指标。而且同为急性期蛋白的C-反应蛋白(CRP)与ⅡA具有相似的来源和合成刺激物，两者在SAP患者中呈平行变化，但就测定成本和手段来看，CRP较其他血清指标更有优势[34]。胰酶活化肽也可部分反映AP病情严重程度，其中尿中分别来自胰蛋白酶和原羧肽酶B的TAP和CAPAP具有较高的灵敏度和特异性，但其临床应用价值尚需进一步验证[35]。尿中ⅠB活化肽PLAP于AP早期增高，但与远处器官损害发生与否无关[36]。

总之，PLA2在SAP发生发展中的作用与其分子类型、组织细胞分布及局部微环境有关。ⅠB和ⅡA是目前认为与AP关系最为密切的sPLA2，其中ⅠB主要参与胰腺局部病理发生过程，而非胰腺来源的ⅡA具有抗菌功能，其血清水平在SAP的系统反应时显著升高，其产生受TNF-α、IL-6等促炎细胞因子诱导，并与血清CRP增高平行，但有关两种sPLA2在远处器官损伤中所起作用及其机制尚存争议，无法完全用膜磷脂水解解释，可能涉及受体途径或经其他类型sPLA2的作用。PLA2家族表达谱的种属差异较大，动物实验结果常不完全适用于人类。直接针对ⅡA的干预措施对SAP及多器官损伤的治疗效果不明确反而增加感染风险。此外，有待通过对体液ⅡA或其他类型sPLA2水平的临床大样本动态检测，评价其对AP进展及预后的临床预测价值。

[1] Six DA,Dennis EA.The expanding superfamily of phospholipase A2 enzymes:classification and characterization.Biochim Biophys Acta,2000,1488:1-19.

[2] Lambeau G,Gelb MH.Biochemistry and physiology of mammalian secreted phospholipases A(2).Ann Rev Biochem,2008,77:495-520.

[3] Hanasaki K.Mammalian phospholipase A2:phospholipase A2 receptor.Biol Pharm Bull,2004,27:1165-1167.

[4] Arbibe L,Koumanov K,Vial D,et al. Generation of lyso-phospholipids from surfactant in acute lung injury is mediated by type-Ⅱ phospholipase A2 and inhibited by a direct surfactant protein A-phospholipase A2 protein interaction.J Clin Invest,1998,102:1152-1160.

[5] Pruzanski W,Vadas P,Stefanski E,et al.Phospholipase A2 activity in sera and synovial fluids in rheumatoid arthritis and osteoarthritis.Its possible role as a proinflammatory enzyme.J Rheumatol,1985,12:211-216.

[6] Weiss J,Inada M,Elsbach P,et al.Structural determinants of the action against Escherichia coli of a human inflammatory fluid phospholipase A(2) in concert with polymorphonuclear leukocytes.J Biol Chem,1994,269:26331-26337.

[7] Piris-Gimenez A,Paya M,Lambeau G,et al.In vivo protective role of human group IIA phospholipase A(2) against experimental anthrax.J Immunol,2005,175:6786-6791.

[8] Laine VJ,Grass DS,Nevalainen TJ.Protection by group Ⅱ phospholipase A2 against Staphylococcus aureus.J Immunol,1999,162:7402-7408.

[9] Nevalainen TJ,Graham GG,Scott KF.Antibacterial actions of secreted phospholipases A2.Biochim Biophys Acta,2008, 1781:1-9.

[10] Murakami M,Kambe T,Shimbara S,et al.Different functional aspects of the group Ⅱ subfamily (Types ⅡA and Ⅴ) and type Ⅹ secretory phospholipase A(2)s in regulating arachidonic acid release and prostaglandin generation.Implications of cyclooxygenase-2 induction and phospholipid scramblase-mediated cellular membrane perturbation.J Biol Chem,1999,274:31435-31444.

[11] Bezzine S,Koduri RS,Valentin E,et al. Exogenously added human group Ⅹ secreted phospholipase A(2) but not the group ⅠB,ⅡA,and Ⅴ enzymes efficiently release arachidonic acid from adherent mammalian cells.J Biol Chem,2000,275:3179-3191.

[12] Birts CN，Barton CH,Wilton DC,et al.A catalytically independent physiological function for human acute phase protein group ⅡA phospholipase A(2)-cellular uptake facilitates cell debris removal.J Biol Chem,2008,283:5034-5045.

[13] Leung SY,Chen X,Chu KM,et al.Phospholipase A2 group ⅡA expression in gastric adenocarcinoma is associated with prolonged survival and less frequent metastasis.Proc Nat Acad Sci USA,2002,99:16203-16208.

[14] Saegusa J,Akakura N,Wu CY,et al.Pro-inflammatory secretory phospholipase a2 type ⅡA binds to integrins alphavbeta3 and alpha 4 beta 1 and induces proliferation of monocytic cells in an integrin-dependent manner.J Biol Chem,2008,283:26107-26115.

[15] Pruzanski W,Vadas P.Phospholipase A2—a mediator between proximal and distal effectors of inflammation.Immunol Today,1991,12:143-146.

[16] Nevalainen TJ,Grönroos JM,Kortesuo PT.Pancreatic and synovial type phospholipase A2 in serum samples from patients with severe acute pancreatitis.Gut,1993,34:1133-1136.

[17] Nevalainen TJ,Eerola LI,Rintala E,et al.Time-resolved fluoroimmunoassays of the complete set of secreted phospholipases A2 in human serum.Biochim Biophys Acta,2005,1733:210-223.

[18] Pruzanski W,Wilmore DW,Suffredini A,et al.Hyperphospholipasemia A2 in human volunteers challenged with intravenous endotoxin.Inflammation,1992,16:561-570.

[19] Nevalainen TJ,Haapamäki MM,Grönroos JM.Roles of secretory phospholipases A2 in inflammatory diseases and trauma.Biochim Biophys Acta,2000,1488:83-90.

[20] Mayer JM,Laine VJ,Kolodziej S,et al.Acute pancreatitis in transgenic mice expressing human group IIA phospholipase A2.Pancreas,2002,25:188-191.

[21] Crowl RM,Stoller TJ,Conroy RR,et al.Induction of phospholipase-A2 gene expression in human hepatoma cells by mediators of the acute phase response.J Biol Chem,1991,266:2647-2651.

[22] Talvinen KA,Kemppainen EA,Nevalainen TJ.Expression of group Ⅱ phospholipase A2 in the liver in acute pancreatitis.Scand J Gastroenterol,2001,36:1217-1221.

[23] Zeiher BJ,Steingrub J,Laterre PF,et al.LY315920NA/S-5920,a selective inhibitor of group ⅡA secretory phospholipaseA2,fails to improve clinical outcome for patients with severe sepsis.Crit Care Med,2005,33:1741-1748.

[24] Yrjänäinen H, Hytönen J, Song XR, et al. Anti-TNF-α-treatment activates Borrellia burgdorferi infection in ceftriaxone treated C3H/He mice.J Infect Dis,2007,195:1489-1496.

[25] Kimura W,Secknus R,Fischbach W,et al.Role of phospholipase A2 in pancreatic acinar cell damage and possibilities of inhibition:studies with isolated rat pancreatic acini.Pancreas,1993,8:70-79.

[26] Motoyoshi M,Sugiyama,Atomi Y,et al.In vivo effect of pancreatic phospholipase A2 on the arachidonic acid cascade.Int J Pancreatol,2001,29:69-76.

[27] Hongo H,Takano H,Imai A,et al.Pancreatic phospholipase A2 induces bacterial translocation in rats.Immunopharmacol Immunotoxicol,1999,21:717-726.

[28] Grönroos JM,Nevalainen TJ.Increased concentrations of synovial-type phospholipase A2 in serum and pulmonary and renal complications in acute pancreatitis.Digestion,1992,52:232-236.

[29] Tsukahara Y,Morisaki T,Horita Y,et al.Phospholipase A2 mediates nitric oxide production by alveolar macrophages and acute lung injury in pancreatitis.Ann Surg,1999,229:385-392.

[30] Zhang XP,Wang L,Zhou YF.The pathogenic mechanism of severe acute pancreatitis complicated with renal injury:A review of current knowledge.Dig Dis Sci,2008,53:297-306.

[31] Zhang XP,Wang L,Zhang J.Study progress on mechanism of severe acute pancreatitis complicated with hepatic injury.J Zhejiang Univ Sci B,2007,8:228-236.

[32] Mayer J,Rau B,Grewe M,et al.Secretory phospholipase A2 in patients with infected pancreatic necroses in acute pancreatitis.Pancreas,1998,17:272-277.

[33] Hietaranta A,Kemppainen E,Puolakkainen P,et al.Extracellular phospholipases A2 in relation to systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and systemic complications in severe acute pancreatitis.Pancreas,1999,18:385-391.

[34] Papachristou GI,Whitcomb DC.Predictors of severity and necrosis in acute pancreatitis.Gastroenterol Clin N Am,2004,33:871-890.

[35] Borgström A,Appelros S,Möller CA,et al.Role of activation peptides from pancreatic proenzymes in the diagnosis and prognosis of acute pancreatitis.Surgery,2002,131:125-128.

[36] Mayer JM,Raraty M,Slavin J,et al.Severe acute pancreatitis is related to increased early urinary levels of the activation peptide of pancreatic phospholipase A2.Pancreatology,2002,2:535-542.

2010-10-19)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.026

100853 北京，解放军总医院全军肝胆外科研究所

黄志强，Email:wys936602@163.com