茶多酚协同超高压处理对枯草芽孢杆菌的灭活效果研究

杭瑜瑜

(琼州学院理工学院，海南三亚572022)

早在19世纪末H.Royer＆Bert Hite等人就利用高压杀死牛奶、果汁、蔬菜汁中的微生物［1］.超高压处理灭菌的同时有效保留食品的色泽、风味和营养成分［2］，目前已成为一种有效的物理杀菌方法［3］.Alemen等［4］指出，在室温下(25℃)600MPa以下的压力即可杀灭一般微生物的营养细胞，而杀死细菌芽孢和真菌孢子在室温下需要1000MPa甚至以上的压力［5］.

超高压与保鲜剂协同处理对微生物的干扰作用明显增强.经超高压处理后，微生物细胞膜被破坏［6］，加速了保鲜剂的渗透.采用超高压与保鲜剂协同处理既可解决压力增大所带来的设备体积和成本增大的要求，又可达到良好的杀灭微生物的效果［7］.

茶多酚是一种良好的天然抗菌剂，对19个细菌类群的12个类群近100种细菌均有抑制作用.茶多酚对金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、伤寒沙门氏杆菌、志贺氏痢疾杆菌、铜绿色假单孢杆菌、枯草杆菌、口腔变异链球菌、大肠埃希氏杆菌 8种致病菌的最低抑制浓度分别为 0.08%、0.01%、0.03%、0.04%、0.08%、0.08%、0.1%、0.1%［8］.本文对茶多酚协同超高压杀灭枯草芽孢杆菌进行了研究，以期寻找有效地降低杀菌压力的方法.

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种枯草芽孢杆菌1.1474，购于中国科学院微生物所.

1.1.2 试验试剂固体培养基:营养琼脂(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，用15%氢氧化钠校正pH至7.4)，分装，121℃灭菌15min备用.液体培养基:营养肉汁(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，用15%氢氧化钠校正pH至7.4)，分装，121℃灭菌15min备用.

菌种经活化后，接入液体培养基，37℃，培养48h.

无菌生理盐水(0.85%的氯化钠水溶液)，K2HPO4、KH2PO4、茶多酚(纯度98%，杭州浙大茶叶科技有限公司).

1.2 试验仪器与设备超高压处理装置(HPB.A2—600/0.6)，天津市华泰森淼生物工程技术有限公司;真空包装机(DZD－400/2s)，江苏腾通包装机械有限公司;超净工作台(SW－CJ－2FD)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;高压蒸汽灭菌锅(AMA240/440)，英国ASTELL公司;生化培养箱(LRH－250A)，广东省医疗器械厂.

1.3 试验方法

1.3.1 超高压处理为了保证枯草芽孢杆菌营养体与芽孢稳定的比例，将其37℃，140r/min震荡培养约48h，然后5000r/min离心15min，弃上清液，沉淀下的菌体用无菌生理盐水洗涤一次，再以pH6.8磷酸缓冲液制成菌悬液，调整细胞浓度，使起始菌数N0为109cfu/mL，然后将其分装于l0mL的无菌聚乙烯塑料袋，并加入相应量的茶多酚，真空包装、冷藏备用，每一样品重复3次.高压容器的温度通过其夹套内恒温水浴来控制，将供试样品提前几分钟置于高压容器介质中，待样品温度与高压介质温度达到平衡后，进行超高压处理.处理后立即进行微生物计数.同时取未经超高压处理的菌悬液作为对照.

1.3.2 微生物数量测定根据中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验方法(GB/T4789－2003)检测经超高压处理和未处理(对照样)的菌悬液的菌落数(单位:cfu/mL)

1.3.3 试验方法设计采用统计软件Design－Expert 7.0.0的Pentagonal模式，以压力和茶多酚浓度2个因子为自变量，分别以X1、X2表示，并根据现有试验条件、研究经验及研究报道，其取值范围确定为100～500MPa和0.5～1.5mg/mL，同时固定处理温度为20℃和处理时间为10min.按方程xi=(Xi－X0)/△X对自变量进行编码(xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长)，并以自变量的编码值+1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平的编码值，超高压处理后残存的枯草芽抱杆菌的对数数量级Y为响应值(Y=Iog10Nt，其中Nt为超高压处理后菌悬液中的活菌数)，试验自变量因素编码及水平见表1.

表1 试验因素水平及编码

假设由最小二乘法拟合的二次多项方程为:Y=B0+Blx1+B2x2+B12x1x2+B11x12+B22x22

其中 Y= －Iog10Nt，B0为常数项，B1、B2分别为线性系数，B12为交互项系数，B11、B22为二次项系数.为了求得此方程的各项系数，至少须8组试验来求解.试验设计及结果见表2.

2 试验结果与分析

2.1 回归方程的建立及其显著性检验采用统计软件Design－Expert7.0.0进行试验设计并优化出来的8组试验安排以及结果见表2.

表2 试验设计及结果

采用Design Expert 7.0.0对表2数据进行回归分析，得到两元一次回归模型方程为:

对该模型进行方差分析，结果见表3，模型系数显著性检验见表4.

表3 回归模型方差分析

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值0.044 1 0.044 4.35 0.1724 x22 8.279E －003 1 8.279E －003 0.82 0.4615残差 0.11 5 0.022失拟项 0.091 3 0.030 3.01 0.2593纯误差 0.020 2 0.010总和 9.09 7模型的确定系数R －Squared=0.9978 x12模型的调整确定系数Adj R －Squared=0.9922

表4 回归方程系数显著性检验

对表3、4的数据进行分析可得出如下结果:

(1)模型p值=0.0056＜0.05表明模型极显著，不同处理间的差异极显著;失拟项 P=0.2593＞0.05，模型的失拟度不显著.(2)模型的调整确定系数RAdj2=0.9922，说明该模型能解释99.22﹪响应值的变化，模型拟合程度良好.该模型在本实验规定自变量变化范围内，可以用此模型对茶多酚协同作用下超高压杀灭枯草芽抱杆菌进行分析和预测.(3)由回归系数显著性检验可知，模型中 x1(p=0.0012 ＜0.05)、x2(p=0.0127 ＜0.05) ，交互项及二次项均不显著.

2.2 茶多酚协同超高压杀菌的响应曲面分析X1和X2对响应值的影响如图1所示.

图1 Y=f(X1，X2)的响应曲面和等高线

从图1的等高线图中可以看出:压力恒定，随着茶多酚浓度的增大，残存的枯草芽抱杆菌数量级Y值随之减少，但是其减少幅度不大;茶多酚浓度恒定，随着压力的增大，残存的枯草芽抱杆菌数量级Y急速减少.从等高线或回归方程可以得出:X1=300MPa，X2=1.0mg/mL时，Y=4.28;X1=300MPa，X2=1.5mg/mL 时 Y=3.72;X1=500MPa，X2=1.0mg/mL 时，Y=2.47.

2.3 茶多酚协同超高压杀菌工艺的优化和回归模型的检验为了确保在以上8组试验基础上所建回归模型的准确性，并且优化出若干组具有较好的杀菌效果的超高压杀菌工艺参数，如果把超高压杀菌技术应用于食品工业，因考虑到食品原料污染的微生物指数一般不大于104cfu/g(或cfu/mL)，首先用上述回归模型预测优化出10组微生物数量≤104cfu/mL的工艺参数.再按照10组优化工艺参数进行试验验证，利用统计软件Design Expert进行分析，结果见表5.

由表5可以看出，回归模型预测优化出10组残存的枯草芽孢杆菌数量≤104cfu/mL的2种自变量参数取值范围是:压力为346.72～481.80MPa，茶多酚浓度为0.89 ～ 1.47mg/mL.按照上述10组杀菌工艺参数进行超高压验证实验，结果证明实现了残存的枯草芽抱杆菌数量级Y≤4的目标，平均相对误差为3.26%.充分说明方程模型是合适有效的.

表5 回归模型所优化的10组响应预侧值≤4的杀菌工艺参数以及验证结果

3 结论

研究了茶多酚协同超高压处理对枯草芽孢杆菌的杀灭效果，采用响应曲面方法中的Pentagonal模式，对压力和茶多酚浓度2个因素进行了优化设计.试验结果表明:(1)压力、茶多酚浓度是影响超高压杀灭枯草芽孢杆菌的显著影响因素，分析表明其显著度顺序为压力＞茶多酚浓度.(2)在本试验条件范围内建立的超高压杀灭枯草芽抱杆菌的回归模型有效，并可用于预测本试验条件范围内以及附近取值的枯草芽抱杆菌超高压杀菌结果.(3)优化得出10组残存枯草芽孢杆菌对数数量级≤4的工艺参数的取值范围为:压力为346.72 ～481.80MPa，茶多酚浓度为0.89 ～1.47mg/mL.

［1］Houska M，Strohalm J，Kocurova K，et al.High pressure and foods－ fruit/vegetable juices［J］.Journal of Food Engineering，2006，77(3):386～398.

［2］Rahman M S.Handbook of Food Preservation［M］.New York:CRC Press，2007，839～841.

［3］Abe F，Kato C，Horikoshi K..Pressure－regulated metabolism in microorganisms［J］.Trends in Microbiology，1999，7(11):447～453.

［4］Alemen G.D.Pulsed ultra high pressure treatments for pasteurization of pineapple juice［J］.Food Science，1996，61(2):388 ～390.

［5］卢蓉蓉，钱平，何红艳，等.超高压杀灭低酸性食品中耐压茵的动力学模型［J］.农业工程学报，2010，26(9):350～355.

［6］杭瑜瑜，陆海霞，励建荣.超高压处理对副溶血性弧菌的影响［J］.微生物学报，2009，49(11):1489～1493.

［7］中性体系中超高压－Nisin协同作用下的细菌致死机理［J］.微生物学报，2011，51(1):35～42.

［8］董金甫，李瑶卿，洪绍梅.茶多酚(TPP)对8种致病菌最低抑制浓度的研究［J］.食品科学，1995，16(1):6－12.