附子及附子配伍干姜对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠肾功能的影响

杨金招，范建萍，王友群

(中国药科大学药理研究室，江苏南京 210009)

附子及附子配伍干姜对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠肾功能的影响

杨金招，范建萍，王友群*

(中国药科大学药理研究室，江苏南京 210009)

目的:研究中药附子及附子配伍干姜对腺嘌呤所致小鼠慢性肾衰的疗效，并初步探讨其作用机制。方法:将雄性ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、低剂量附子组、高剂量附子组、低剂量附子+干姜组和高剂量附子+干姜组。正常对照组小鼠灌胃给予蒸馏水;其余各组小鼠灌胃给予腺嘌呤(第1周和第2～4周的给药剂量分别为250和130 mg·kg－1，均为每2天给药1次)，低剂量附子组、高剂量附子组、低剂量附子+干姜组和高剂量附子+干姜组小鼠另分别灌胃给予相应的水煎液，每天1次。实验过程中，记录各组小鼠的一般情况，并于实验结束时，对小鼠血清肌酐、尿素氮、乳酸和乳酸脱氢酶，以及肾组织谷胱甘肽、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和丙二醛的含量进行测定，并记录附睾精子数。结果:与正常对照组相比，模型组和各给药组小鼠体重下降，摄食量减少，饮水量升高;高剂量附子组和低剂量附子+干姜组小鼠饮水量明显低于模型组小鼠。模型组小鼠消瘦、萎靡、被毛发黄干枯不齐，部分死亡;高剂量附子+干姜组和低剂量附子+干姜组小鼠被毛白净有光泽，且活动性更强。高剂量附子水煎液，高剂量附子+干姜水煎液，以及低剂量附子+干姜水煎液对小鼠生化指标具有显著改善作用，可降低肾系数以及血清肌酐、尿素氮、乳酸和乳酸脱氢酶水平，提高精子数;可降低小鼠肾组织GSH水平，升高MDA水平;高剂量附子组和高剂量附子+干姜组小鼠肾组织ALT水平，以及高剂量附子+干姜组和低剂量附子+干姜组小鼠肾组织AST水平均显著高于模型组;低剂量附子组小鼠除个别指标外，无明显的改善。结论:高剂量附子水煎液对腺嘌呤所致慢性肾功能衰竭小鼠肾功能具有一定保护作用，与干姜配伍后其疗效增加，毒性降低。

腺嘌呤;慢性肾功能衰竭;附子;干姜

腺嘌呤是用于诱发慢性肾功能衰竭(CRF)动物模型的常用药物，其造成的CRF从中医的角度上来看，属于肾阳虚［1－2］，该模型的许多症状与人类肾阳虚型CRF的临床表现也十分相似。研究显示，腺嘌呤代谢产物可通过阻塞肾小管而引起肾功能衰竭;也有学者认为腺嘌呤代谢产物具有一定毒性，可使肾组织中与糖、蛋白质和脂肪代谢有关的多种酶活性受到抑制，进而影响肾组织的能量代谢，这可能是腺嘌呤引起肾阳虚症候的机制之一［1，3－4］。附子为毛茛科植物乌头的子根，性味辛、甘，性大热，有毒，归心、肾经，有回阳救逆、补火助阳及散寒止痛之功效，主治阳虚阴盛之证，中医临床一般通过长时间煎煮和配伍用药降低其毒性;干姜为姜科植物姜的干燥根茎，性辛温，无毒，具有温中散寒、回阳通脉及燥湿消痰等功效。笔者通过腺嘌呤诱导的小鼠CRF模型，考察附子对小鼠肾功能的保护作用，以及配伍干姜是否能减小附子毒性并增强其疗效，并初步探讨附子的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

腺嘌呤(批号为9905078，上海博蕴东风生物科技有限公司);川附子(批号为20100726，购自南京市益丰大药房，经中国药科大学中药学院王强教授鉴定为川附子);考马斯亮兰(批号:20101025)、肌酐(Cr)检测试剂盒(批号:20101025)、尿素氮(BUN)检测试剂盒(批号:20101025)、谷丙转氨酶(ALT)检测试剂盒(批号:20101026)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒(批号:20101026)、乳酸(LD)检测试剂盒(批号: 20101026)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(批号: 20101026)、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(批号: 20101026)和丙二醛(MDA)检测试剂盒(批号: 20101026)等均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物

雄性ICR小鼠143只，体重(25±2)g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖厂，动物合格证号: SCXK(苏)2007－0001。

1.3 仪器

721 型分光光度计(上海第三分析仪器厂); 0412－1型低速离心机［上海医疗器械(集团)有限公司］;BS－110－S型电子天平(北京赛多利斯公司)。

2 方法

2.1 水煎液的制备

取附子100 g，加入水1 000 mL，大火煮沸后改为小火微沸60分钟，用脱脂棉过滤，滤渣再加水800 mL以相同方法煮沸、过滤，合并两次滤液，小火浓缩至200 mL，即得每毫升相当于0.5 g附子(低剂量附子)的水煎液;取附子200 g，以相同方法得到每毫升相当于1 g附子(高剂量附子)的水煎液;取附子和干姜各100 g，以相同方法得到每毫升相当于0.5 g附子和0.5 g干姜(低剂量附子+干姜)的水煎液;取附子200 g，干姜100 g，以相同方法得到每毫升相当于1 g附子和0.5 g干姜(高剂量附子+干姜)的水煎液。

2.2 动物分组及给药方案

雄性ICR小鼠随机分为6组:对照组(C组，n= 12)、模型组(M组，n=31)、低剂量附子组(FL组，n=25)、高剂量附子组(FH组，n=25)、低剂量附子+干姜组(FLG组，n=25)和高剂量附子+干姜组(FHG组，n=25)。按照Yokozawa等［5－6］报道的实验方法，分别给对照组小鼠和另外5组小鼠灌胃使用蒸馏水和腺嘌呤水溶液(第1周和第2～4周的给药剂量分别为250和130 mg·kg－1，均为每2天给药1次，上午给药)。FL组、FH组、FLG组和FHG组小鼠在接受腺嘌呤的基础上，每天下午再对其灌胃给予“2.1”项下制备的低、高剂量附子水煎液、低剂量附子+干姜水煎液以及高剂量附子+干姜水煎液(10 mL·kg－1·d－1)，对照组小鼠给予蒸馏水(10 mL·kg－1·d－1，共4周)。

2.3 考察指标

2.3.1 动物一般情况观察给药期间小鼠的身体状况和活动情况，每2天记录1次体重、摄食量及饮水量。

2.3.2 生化指标于实验结束时，摘除小鼠眼球，取其全身血液致死，血样在2 000 r·min－1转速下离心10分钟，然后取上层血清测定其中Cr、BUN、LD及LDH等指标的含量;解剖小鼠并分离其附睾，剪碎并分散于6 mL 37℃生理盐水中，孵育0.5小时后，在显微镜下观察并记录附睾精子数;取右侧肾脏和睾丸，计算肾脏系数(单侧肾脏质量/小鼠体重)和睾丸系数(单侧睾丸质量/小鼠体重);取左侧肾脏组织，按质量体积比1∶9加入生理盐水，在冰浴条件下制成组织匀浆，在3 000 r·min－1转速下离心10分钟后取上清液，测定其中GSH、ALT、AST和MDA等指标的含量;组织蛋白浓度采用考马斯亮兰法测定，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

2.4 统计学处理

实验数据以¯x±s表示，采用t检验方法对组间差异进行显著性分析。

3 结果

3.1 动物一般情况

与正常对照组相比，接受腺嘌呤灌胃给药的各组小鼠体重下降，摄食量减少，各给药组与模型组小鼠体重及摄食变化均无显著性差异(见图1和图2)。接受腺嘌呤灌胃给药的各组小鼠的饮水量均高于正常对照组;与模型组小鼠相比，FH组和FLG组小鼠饮水量明显下降(见图3)。

图1实验期间各组小鼠体重变化Figure 1 Changes in body weights of the mice in different groups during the period of the experiment

图2实验期间各组小鼠摄食量变化Figure 2 Changes in food intake of themice in different groups during the period of the experiment

图3实验期间各组小鼠饮水量变化Figure 3 Changes in water intake of the mice in different groups during the period of the experiment

模型组小鼠消瘦、萎靡、被毛发黄干枯不齐，部分小鼠死亡;与模型组相比，FL组和FH组动物状态未见明显改善，而FLG组和FHG组小鼠被毛白净，且活动性更强，但这4组均有部分小鼠出现死亡。本研究结束时，正常对照组、模型组、FL组、FH组、FLG组和FHG组小鼠死亡率分别为0%(0/ 12)、45.2%(14/31)、20%(5/25)、44%(11/25)、28%(7/25)和36%(9/25)。

3.2 附子及附子配伍干姜水煎液对小鼠肾脏系数、睾丸系数的影响

与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠肾脏系数显著升高(P＜0.001)，睾丸系数无显著性差异，精子数量显著降低(P＜0.01)。与模型组小鼠相比，FH组、FLG组和FHG组小鼠肾脏系数显著降低，FL组、FLG组和FHG组小鼠精子数显著增加，提示单用附子对肾脏和生殖功能有一定保护作用，与干姜配伍后则显示出更显著的疗效(见表1)。

表1各组小鼠肾系数、睾丸系数和精子数(¯x±s，n=8)Table 1 Changes in kidney index，testis index and sperm counts of mice in different groups

3.3 附子及附子配伍干姜水煎液对小鼠血液生化指标的影响

血液生化指标测定结果显示，模型组小鼠血清Cr、BUN、LD和LDH水平均显著低于正常对照组; FH组、FLG组和FHG组小鼠的血清Cr和BUN水平均显著低于模型组，而FL组与模型组无显著差异。FL组、FH组、FLG组和FHG组小鼠血清LD和LDH均显著低于模型组，且FL组、FLG组和FHG组小鼠的血清LDH与正常对照组无显著性差异。

表2各组小鼠血清肌酐、尿素氮、乳酸和乳酸脱氢酶水平测定结果(¯x±s，n=8)Table 2 Results of the content determination for serum Cr，BUN，LD and LDH ofmice in different groups

3.4 附子及附子配伍干姜水煎液对小鼠肾组织生化指标的影响

肾组织生化指标测定结果显示，模型组小鼠肾组织中的GSH水平显著高于正常对照组，而蛋白、MDA、ALT和AST水平显著低于正常对照组。FH组和FLG组小鼠肾组织中GSH水平显著低于模型组，且FLG组小鼠肾组织中GSH水平与正常对照组无显著性差异;FH组、FLG组和FHG组小鼠的肾组织中蛋白和MDA水平显著高于模型组，且FH组小鼠肾组织中的MDA水平与正常对照组无显著性差异;模型组小鼠肾组织中ALT和AST水平均显著低于正常对照组，而FH组和FHG组小鼠肾组织中的ALT水平，以及FLG组和FHG组小鼠肾组织中的AST水平均显著高于模型组(见表3)。

表3肾组织蛋白、谷胱甘肽、丙二醛、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平测定结果(¯x±s，n=8)Table 3 Results of the content determination for protein，GSH，MDA，ALT and AST in kidney ofmice in different groups

4 讨论

在本实验中，FL组小鼠死亡率低于模型组，但结合其生化指标可知，低剂量附子水煎液治疗作用并不明显;FH组小鼠生化指标与模型组具有显著性差异，然而死亡率与模型组相近，提示高剂量附子水煎液有较大毒性;FLG组和FHG组小鼠死亡率明显低于模型组，提示附子与干姜配伍后其毒性下降。

本研究结束时，模型组小鼠的血清Cr和BUN水平分别约为对照组小鼠的3倍和5倍;模型组小鼠肾脏肿大、苍白，表面不光滑，质地坚硬。FH组、FLG组及FHG组小鼠血清Cr和BUN水平均显著低于模型组，表明高剂量附子水煎液、低剂量附子干姜水煎液和高剂量附子干姜水煎液对小鼠肾功能具有一定改善作用;FL组小鼠的血清Cr和BUN水平未见改善。此外，模型组小鼠肾脏肿大，而肾脏蛋白水平却显著低于对照组，故笔者认为腺嘌呤诱导的肾脏病变属于水肿，而非增生。高剂量附子水煎液和低、高剂量附子+干姜水煎液均能显著降低小鼠肾系数，提示附子可能通过促进毒素排泄缓解肾脏水肿，从而降低肾系数。

研究显示，正常情况下，人体20%LD可经肾脏清除，当肾功能受损时，LD的清除势必受到影响，血清LD水平升高，最终引起酸中毒［7－8］。本研究中，模型组小鼠血清LD和LDH水平均显著高于正常对照组小鼠，FH组和FL组小鼠LD水平均低于模型组，但仍高于对照组，表明附子可通过改善肾功能促进LD的清除，但作用有限;当与干姜配伍后，附子的降LD作用加强，FLG组小鼠LD水平最接近于对照组。

转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，广泛存在于动物心肌、脑、肝和肾等组织中，其中以ALT和AST最为重要。ALT可催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨基作用，AST可催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨基作用。本研究中的肾衰模型小鼠肾组织蛋白、ALT和AST水平均显著低于对照组;FH组、FLG组和FHG组小鼠肾组织蛋白浓度，FH、FHG组小鼠肾组织ALT水平，以及FLG组、FHG组小鼠肾组织AST水平，均显著高于模型组小鼠的上述相应指标，可见高剂量附子+干姜水煎液可通过调节ALT和AST活性促进机体蛋白质合成。Ikegwuonu等［9］曾发现，给大鼠腹腔注射黄曲霉素B后，大鼠肾组织AST水平降低，故而其催化生成的天冬氨酸减少，由此导致蛋白质合成减少，该结果与本研究中模型组小鼠肾蛋白及转氨酶水平均显著低于对照组的实验结果一致;然而也有文献报道，将大鼠暴露在强度为108 dB(A)的噪声下，其体内胰岛素分泌减少，细胞和支持细胞的耗氧量增加，使肌肉蛋白质分解加强，大量氨基酸释放，进而诱导ALT活性升高［10］，与本研究结果相悖。因此，关于腺嘌呤和附子配伍干姜影响肾组织ALT和AST水平的确切机制还有待进一步研究。

MDA是细胞膜脂质发生过氧化反应的产物，可用于反映细胞的氧化还原状态。本研究显示，模型组小鼠肾脏MDA水平显著低于对照组，而GSH含量显著高于对照组，提示模型组小鼠肾脏中与氧化还原相关的酶处于低活性状态，这可能是腺嘌呤引起肾阳虚症候的机制之一。FH组、FLG组及FHG组小鼠的肾脏MDA水平均显著高于模型组，FH组和FLG组小鼠肾脏GSH水平低于模型组，提示附子可能通过改善肾脏的能量供应，促进GSH的利用［11］。

本研究通过探索附子配伍干姜对腺嘌呤所致的CRF小鼠的肾功能的改善作用，为附子干姜这一药对的疗效，以及干姜对附子的减毒增效作用提供了佐证，但其具体机制需深入探索。

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The Effects of the Prepared Aconite Lateral Root and the Prepared Aconite Lateral Root Combined with Dried Ginger on Renal Function of Mice w ith Chronic Renal Failure Induced by Adenine

YANG Jin－zhao，FAN Jian－ping，WANG You－qun

(DepartmentofPharmacology，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To observe the therapeutic effects of the prepared aconite lateral root and the prepared aconite lateral root combined with dried ginger on chronic renal failure(CRF)inmice，and to explore the related mechanisms preliminarily.Methods:Male ICRmice were randomly divided into 6 groups including control group，model group，low dose group of prepared aconite lateral root(FL group)and high dose group(FH group)，as well as low dose group of prepared aconite lateral root combined with dried ginger(FLG group)and high dose group(FHG group).Themice in control group and the other groupswere given distilled water and adenine(250 mg⋅kg－1，every two days in the first week;130 mg⋅kg－1，every two days from the second week to the fourth week)by intragastric administration，respectively.Themice in FL group，FH group，FLG group and FHG group were given the corresponding water extracts by intragastric administration once daily.The general conditions of themicewere observed and the contents of creatine(Cr)，urea nitrogen(BUN)，lactic acid(LD)and lactate dehydrogenase(LDH)in blood serum were determined.The kidneys were homogenated for measuring glutathione(GSH)，alanine transaminase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)and malonaldehyde(MDA).Besides，the number of sperm in the left epididymis of mice was recorded.Results:Compared with control group，the body weight and food intake of mice in model group and test groups decreased significantly，with the drinking amount increased.The drinking amount of mice in FH group and FLG group was lower than that of model group.Themice in model group became emaciated，weary and clothing hair－kraurotic，and some died during the experimental period.The mice in FHG group and FLG group had tramosericeous clothing hair，and they were more active.Compared with model group，the biochemical indicators ofmice in FH group，FLG group and FHG group were improved significantly，with the blood Cr，BUN，LD and LDH reduced，and sperm count was raised.Compared withmodel group，the GSH and MDA levels in the nephridial tissue of mice were reduced and raised respectively in the above groups.Moreover，the ALT level of nephridial tissue in FH group and FHG group，as well as the AST level in FLG group and FHG group were higher than those of model group.The biochemical indicators in FL group were not improved，except for a few indexes.Conclusion:The water extract from prepared aconite lateral root of high dose can protect the renal function of mice with chronic renal failure induced by adenine.Dried ginger can enhance the effects of the prepared aconite lateral root，and reduce its toxicity.

adenine;chronic renal failure;prepared aconite lateral root;dried ginger

R 289.1;R 285.5

B

1001－5094(2011)05－0224－06

10.3969/j.issn.1001－5094.2011.05.005

［接受日期］2011－02－21

*通讯作者:王友群，副教授;

研究方向:心血管药理;

E-mail:wyqfbox@163.com

(责任编辑:杨臻峥)

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