磺丁基醚－β－环糊精手性流动相添加剂法分离盐酸昂丹司琼对映体

孙文芳，王伟，严拯宇

(中国药科大学分析化学教研室，江苏南京 211198)

磺丁基醚－β－环糊精手性流动相添加剂法分离盐酸昂丹司琼对映体

孙文芳，王伟*，严拯宇＊＊

(中国药科大学分析化学教研室，江苏南京 211198)

目的:建立反相高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分盐酸昂丹司琼对映体。方法:采用Hedera C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱，考察手性添加剂的种类和浓度、水相pH、缓冲盐的种类和浓度、有机相的种类和比例、柱温等对盐酸昂丹司琼对映体拆分效果的影响。结果:当流动相为10 mmol·L－1NaH2PO4溶液(含5 mmol·L－1磺丁基醚－β－环糊精，磷酸调至pH 3.0)－甲醇(75∶25)，检测波长为310 nm，流速为1.0 mL·min－1，柱温为25℃时，盐酸昂丹司琼对映体可达到基线分离。结论:该方法可实现盐酸昂单司琼对映体基线分离，且操作简便，比手性固定相法更经济。

反相高效液相色谱法;盐酸昂丹司琼;手性流动相添加剂;磺丁基醚－β－环糊精;对映体分离

盐酸昂丹司琼(ondansetron hydrochloride，1)，化学名为(±)－2，3－二氢－9－甲基－3－［(2－甲基－咪唑－1－基)甲基］－4(1H)－咔唑酮盐酸盐二水合物，是葛兰素公司于1990年投放市场的第一个高选择性5－HT3受体拮抗剂，用于预防和治疗癌症患者因化疗所致恶心和呕吐等，具有高效、低毒、安全等特点。目前有关昂丹司琼对映体分离方法的文献报道主要集中在对手性固定相，如蛋白质及纤维素衍生物手性固定相、万古霉素手性固定相、直链淀粉手性固定相的选择与应用上［1－3］;此外，也有人将毛细管电泳手性添加剂法用于其对映体的分离［4－5］。然而，手性柱价格昂贵且易损坏，毛细管电泳色谱法则重现性较差，因此，笔者尝试选用适当的手性流动相添加剂，在普通C18色谱柱上拆分盐酸昂丹司琼对映体。考虑到盐酸昂丹司琼的结构中有3个N原子，可形成带正电的阳离子，且其结构中含疏水性的刚性结构，按照Dalglesish的三点作用理论，其可分别与磺丁基醚－β－环糊精(SBE－β－CD)疏水性空腔的内部和键合在环糊精上的磺丁基所形成的阴离子产生相互作用，达到手性拆分的效果，本文以SBE－β－CD为手性流动相添加剂，在Hedera C18柱上成功分离了盐酸昂丹司琼对映体。该法拓宽了带负电的环糊精衍生物作为手性流动相添加剂的应用范围，对研究昂丹司琼与磺丁基醚－β－环糊精的相互作用提供了理论依据，同时对于昂丹司琼单一对映体的开发、质量控制及立体选择性药动学研究具有实际意义［6－9］。

1 实验部分

1.1 仪器、药品与试剂

LC－10AT型液相色谱仪、SPD－10Avp紫外检测器(均为日本岛津公司);BS124S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);PHS－3C型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

盐酸昂丹司琼消旋体(武汉医药原料厂，化学纯度＞99.0%);β－环糊精(β－CD，国药集团化学试剂有限公司)，羟丙基－β－环糊精(HP－β－CD，平均取代度为6.0，泰兴一鸣生物有限公司)，SBE－β－CD (平均取代度为6.2，南京师范大学超分子化合物重点研究室馈赠);甲醇(江苏汉邦科技有限公司，色谱纯)，乙腈(MERCK化学试剂，色谱纯)，醋酸铵(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，磷酸二氢钠、磷酸(均为南京化学试剂有限公司，分析纯);水为市售纯净水。

1.2 色谱条件

色谱柱:汉邦Hedera ODS－2柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:10 mmol·L－1NaH2PO4溶液(含5 mmol·L－1SBE－β－CD，磷酸调节pH至3.0)－甲醇(75∶25);流速为1.0 mL·min－1;柱温:25℃;检测波长为310 nm;进样量:20μL。

1.3 供试品溶液的制备

取盐酸昂丹司琼10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得1 000 mg·L－1的盐酸昂丹司琼贮备液。精密移取1 mL贮备液至10 mL容量瓶中，用流动相稀释定容，得100 mg·L－1的盐酸昂丹司琼溶液，作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 影响分离的因素考察

2.1.1 手性添加剂种类及浓度对分离的影响在10 mmol·L－1NaH2PO4溶液(磷酸调至pH 3.0)中，分别添加β－CD、HP－β－CD和SBE－β－CD作为流动相水相，其余色谱条件同“1.2”节，分离盐酸昂丹司琼对映体。结果表明:β－CD、HP－β－CD作为手性添加剂时，对映体完全无法分离，仅SBE－β－CD可使盐酸昂丹司琼对映体达到基线分离。进一步考察SBE－β－CD的浓度对盐酸昂丹司琼对映体的分离度R和保留时间tR产生的影响时发现，当SBE－β－CD浓度为1～10 mmol·L－1时，随浓度的增加，保留时间tR减少，分离度R逐渐增加，但当浓度达2.5 mmol·L－1以上时，增加浓度对分离度的影响不再明显(见表1)。

表1 SBE-β-CD浓度对分离的影响Table 1 The influence of sulfobutyl ether－β－cyclodextrin concentration on the separation

这其中的原因可能是SBE－β－CD浓度低时，随着浓度的增加，盐酸昂丹司琼与手性添加剂相互作用的概率增大，导致分离度增加，保留时间减少;而当SBE－β－CD浓度较高时，盐酸昂丹司琼与手性添加剂相互作用达到阈值，浓度不再成为影响分离度的主要因素，此时，药物－环糊精复合物与未结合环糊精的竞争作用导致保留时间继续减少。考虑到SBE－β－CD浓度过大不仅增加柱压，对色谱柱也有较大损伤，故最终选择5 mmol·L－1SBE－β－CD作为手性添加剂的浓度。

2.1.2 水相pH对分离的影响用磷酸将含5 mmol·L－1SBE－β－CD的10 mmol·L－1NaH2PO4溶液调至不同的pH值，其余色谱条件同“1.2”节，分离盐酸昂丹司琼对映体。结果表明:在pH 3.0～6.0范围内，随pH增加，对映体的保留时间呈增加趋势，而分离度变化并不明显(见表2)。考虑到pH较高时，对映体保留时间过长，故最终选择水相pH为3.0。

表2水相pH对分离的影响Table 2 The influence ofwater phase pH on the separation

2.1.3 缓冲盐的种类和浓度对分离的影响分别用10 mmol·L－1的NaH2PO4溶液和20 mmol·L－1的 CH3COONH4溶液(均含5 mmol·L－1SBE－β－CD，用磷酸调节pH为3.0)作为流动相水相，其余色谱条件同“1.2”节，对盐酸昂丹司琼对映体进行分离。结果表明:在其他条件相同的情况下，缓冲盐的种类对对映体的分离无明显影响(见表3)，考虑到NaH2PO4溶液相对CH3COONH4溶液有更宽的pH缓冲范围，因此选择NaH2PO4溶液作为缓冲盐。进一步比较了不同浓度的NaH2PO4溶液(10、20 mmol ·L－1)对分离的影响，发现其浓度虽对分离不产生影响，但浓度较高时会延长保留时间，故选择NaH2PO4缓冲盐浓度为10 mmol·L－1。

表3缓冲盐的种类和浓度对分离的影响Table 3 The influence of the type and concentration of buffer on the separation

2.1.4 有机相的种类和比例对分离的影响在不改变水相组成的基础上，分别以甲醇、乙腈为有机相，其余色谱条件同“1.2”节，考察不同有机相及流动相的比例对盐酸昂丹司琼对映体分离的影响。结果表明:乙腈的洗脱能力更强，但甲醇的分离能力更佳，在洗脱较快的对映体保留时间同为18 min时，以乙腈为有机相时得到的对映体分离度为1.80，而以甲醇为有机相时的分离度达2.27。此外，甲醇体积分数为25%时，两对映体可达到基线分离，保留时间分别为18和20 min;而当甲醇体积分数从25%减小到20%时，分离度虽稍有增加，但保留时间显著延长;当甲醇体积分数由25%增至30%时，两对映体分离度显著降低，无法达到基线分离。综上，最终选择25%甲醇为流动相的有机相。

2.1.5 柱温对分离的影响在其他分离条件同“1.2”节的情况下，考察柱温为25、30、35、40℃时，盐酸昂丹司琼对映体的分离情况。结果显示，随着温度的升高，保留时间减少，分离度也略有降低(见表4)。从分离度的变化趋势判断，低温较有利于分离，同时考虑到方法的适用性，故最终选择柱温为25℃。

表4柱温对分离的影响Table 4 Influences of column temperature on the separation

2.2 方法有效性考察

本实验对优化色谱条件下盐酸昂丹司琼的线性范围、进样精密度和最低检测限作了进一步考察。配制质量浓度分别为10、20、60、100、120、140、180 mg·L－1的盐酸昂丹司琼系列标准溶液，按照“1.2”项下色谱条件，进样，记录色谱图(见图1)。并以峰面积(A)对溶液质量浓度(C，mg·L－1)进行回归，得对映体A和B的面积－浓度回归方程分别为:

另将100 mg·L－1的盐酸昂丹司琼溶液连续进样6次，结果得两对映体保留时间的RSD分别为0.39%和0.37%，峰面积的RSD分别为0.73%和1.2%，表明该实验条件下盐酸昂丹司琼各个单体的保留时间和响应峰面积的重复性良好。将100 mg·L－1的盐酸昂丹司琼溶液多次稀释后得到信噪比(S/N)为3的溶液，将此浓度作为最低检测限，结果显示，盐酸昂丹司琼两对映体单体的最低检测限均为18μg·L－1。

图1盐酸昂丹司琼对映体的色谱图Figure 1 Chromatogram of ondansetron hydrochloride enantiomers

3 结论

以SBE－β－CD为手性流动相添加剂的RP－HPLC法，载样量远高于毛细管电泳法，方法稳定性较好，此外，该法还能获得较低的检测限和较高的线性和精密度，在保证盐酸昂丹司琼两个单体间达到完全分离的前提下，可作为盐酸昂丹司琼单一对映体含量测定的方法。

［1］尹燕杰，张启明，田颂九.蛋白质及纤维素衍生物手性固定相分离盐酸昂丹司琼对映体［J］.药物分析杂志，2009，29(6):971－974.

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Enantiomeric Separation of Ondansetron Hydrochloride by RP-HPLC Using Sulfobutyl Ether-β-cyclodextrin as a Chiral Additive

SUNWen－fang，WANGWei，YAN Zheng－yu

(DepartmentofAnalyticalChemistry，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing211198，China)

Objective:To establish a HPLCmethod with a chiralmobile phase additive for the enantiomeric separation of ondansetron hydrochloride.MethodsThe Hedera C18column(250 mm×4.6 mm，5μm)was used.The influences of type and concentration of sulfobutyl ether－β－cyclodextrin，buffer pH，the type and concentration of buffer，the type and ratio of organic phase and column temperature on the resolution of enantiomers were investigated.Results:The baseline separation of ondansetron hydrochloride enantiomers was achieved at25℃on the reversed－phase C18column with amobile phase of10 mmol⋅L－1NaH2PO4(containing 5mmol⋅L－1sulfobutyl ether－β－cyclodextrin，pH 3.0)－methanol(75∶25)at the flow rate of 1.0 mL⋅min－1.Conclusion:Ondansetron hydrochloride enantiomers can be baseline－separated bythismethod which is simple and economic with good resolution.

RP－HPLC method;ondansetron hydrochloride;chiral mobile phase additive;sulfobutyl ether－β－cyclodextrin;enantiomeric resolution

R 914

B

1001－5094(2011)05－0220－04

10.3969/j.issn.1001－5094.2011.05.004

［接受日期］2011－01－28

*通讯作者:王伟，讲师;

研究方向:仪器分析;

Tel:025－86185150;E-mail:qkhcpu@126.com

＊＊通讯作者:严拯宇，教授;

研究方向:仪器分析;

Tel:025－86185150;E-mail:yanzhengyujiang@hotmail.com

(责任编辑:邢爱敏)