淫羊藿素体外抗淋巴瘤细胞增殖效应

范双翼，余英豪

（南京军区福州总医院病理科，福州 350025）

抗肿瘤药物的研究一直是药物研发的热点，而植物药成为抗肿瘤药物的重要来源之一，如紫杉醇、长春花碱等，都是一线抗肿瘤药物。淫羊藿素（icaritin，ICT），是来源于小檗科淫羊藿属植物的活性成分，其化学结构属黄酮类化合物。分子式为C20H20O6，分子量356.38。其化学结构式为：

近年来，ICT抗肿瘤作用备受人们关注［1，2］，但对淋巴瘤的作用尚未见报道。本实验选择EL-4细胞做为载体，研究 ICT体外对淋巴瘤细胞的作用并分析其可能机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株

EL-4小鼠淋巴瘤细胞，购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。悬浮生长于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置5％CO2、37℃培养箱中常规培养。1～2 d换液一次，3～4 d传代。

1.2 主要试剂

淫羊藿素（ICT）由第二军医大学殷正丰教授馈赠（纯度99％）。RPMI-1640为Hyclone公司产品。胎牛血清（FBS）为奥地利PAA公司产品。二甲基亚砜（DMSO）、MTT（噻唑蓝）为 Sigma公司产品。TrizolTM RNA Isolation Reagent、DEPC 为 美 国Invitrogen公司产品。AMV 反转录试剂盒为Promega Reverse Transcription System A3500。PCR试剂盒为Takara rTaq。DNA Marker（600 bp）为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。Caspase-3、9分光光度法检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。DNA-PREP RENGENT KIT为美国COULER公司产品。

1.3 M TT法检测细胞增殖

根据 ICT浓度不同，分为1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L组，同时设未加药物的阴性对照组。每组样本设4个平行孔，选取生长状况良好，活细胞数大于95％的细胞，起始浓度1×105个/L接种于96孔板中，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下，分别培养24 h、48 h和72 h，置酶标仪下测定OD值。以下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（％）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100％。量效关系曲线分析计算IC50值。

1.4 超微结构观察

未加药物组EL-4细胞与40μmol/L ICT作用6 h细胞各一瓶，经 PBS漂洗，2.5％戊二醛-1.5％多聚甲醛及1％锇酸固定，环氧树脂618包埋，超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅染色，Philips-EM208S透射电镜观察并摄片。

1.5 流式细胞术检测

实验组ICT浓度分别为40μmol/L、80μmol/L。对照组为未加药物的细胞。收集细胞，离心，PBS洗涤，300目过滤网过滤后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/m L，按DNA-PREP RENGENT KIT试剂盒操作步骤进行操作，在染色20 min后上机检测。用COULER Muticycle分析系统对检测结果进行分析。

1.6 基因m RNA表达的半定量RT-PCR检测

40μmol/L ICT处理6 h的EL-4细胞，用Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，以获得的cDNA为第一链，以Bcl-2、P21基因引物进行PCR扩增，同时选用GAPDH作为内参照。DNA扩增产物进行凝胶电泳分析。

1.7 Caspase-3与Caspase-9活力测定

40μmol/L ICT作用EL-4细胞6 h，同时设立阴性对照组，用PBS洗涤细胞二次，收集细胞沉淀，加入裂解液置冰上裂解40 m in，离心后取少量上清，BCA法测定蛋白浓度。吸取50μL含100～200μg蛋白的细胞裂解上清，加入50μL的反应液及5μL Caspase-3，于37℃避光孵育4 h。设立空白对照组，用分光光度计在λ=400 nm测定其吸光值。通过计算OD实验组/OD对照组的倍数来确定实验组 Caspase-3活化程度。同法确定Caspase-9活化程度。

1.8 统计学处理

应用 SPSS13.0统计分析软件对 Caspase-3、Caspase-9采用t检验分析，抑制率采用x2检验进行统计学处理。数据以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为有显著性差异；P＜0.01为极显著性差异。

2 结果

2.1 M TT法检测 ICT对 EL-4细胞增殖的抑制作用

采用不同浓度ICT处理EL-4细胞24 h，各实验组与对照组细胞增殖抑制率比较均具有显著性差异（P＜0.05），见表1。算得ICT作用24 h IC50值为5.26μmol/L。10μmol/L ICT分别作用于 EL-4细胞12 h、24 h、48 h，各作用时间点EL-4细胞的增殖均受到抑制，与对照组比较具有显著性差异（P＜ 0.05），见表2。上述结果表明，ICT对EL-4细胞增殖的抑制作用有剂量和时间性。

表1 不同浓度ICT处理24 h的EL-4细胞增殖抑制率Tab.1 The inhibition ratio of EL-4 cells in differrent dose of ICT after 24 h

图1 倒置显微镜下不同浓度ICT处理24 h细胞形态比较Fig.1 Themorphology comparison of cells in different dose of ICT after 24 h under inverted microscope

表2 10μmol/L ICT处理不同时间的EL-4细胞增殖抑制率Tab.2 The inhibition ratio of EL-4 cells in 10μmol/LICT after different time

倒置显微镜下可见实验组细胞结构不完整，细胞内颗粒增多，细胞数量减少，且随着加药浓度的增加，这种变化趋于明显（图1A-D）。

2.2 ICT对EL-4细胞凋亡的诱导作用

2.2.1 EL-4细胞超微结构观察

（1）对照组EL-4细胞：镜下瘤细胞弥漫成片分布，细胞间不粘着，无连接复合体及桥粒。瘤细胞中等大小，形态单一，圆形或椭圆形，胞质稍丰富，胞质内细胞器量中等，部分细胞表面有小突起。瘤细胞核较大，圆形或卵圆形，部分不规则。染色质以常染色质为主，异染色质少，分散排列或位于核膜下，核仁明显，1个或多个。瘤细胞核浆比例高。可见到个别凋亡细胞（彩插1图2～4）。

（2）40μmol/L ICT作用EL-4细胞6 h：出现大量凋亡细胞，呈现典型的细胞凋亡形态学改变。早期表现为核异染色质增多、浓缩、结块边集，核膜水肿、间隙增宽，胞质浓缩深染；中期染色质聚集在核膜下形成半月形、环状、块状和其它不规则形状，核膜水肿加重，间隙加宽；后期核裂解，形成多个凋亡小体（彩插1图5～7）。

2.2.2 流式细胞术检测ICT作用后EL-4细胞凋亡

40μmol/L、80μmol/L的 ICT作用 EL-4细胞6 h，凋亡细胞百分率分别为12.3％和71.7％。随着剂量增高，凋亡百分率亦增高。如图8～10所示。

图8 对照组Fig.8 The control group

图9 40μmol/L实验组，可见到明显凋亡峰Fig.9 40μmol/L group，the apoptotic peak can be seen clearly

2.3 ICT对EL-4细胞凋亡相关基因m RNA表达的影响

由图11可见紫外光下显示明亮清晰的18 s与28 s两条rRNA带，说明提取的RNA完整。EL-4细胞处理组（40μmol/L ICT作用6 h）与对照组比较显示，Bcl-2、P21的 mRNA在药物作用后表达明显下调（图11）。

图10 80μmol/L实验组，凋亡峰愈加明显Fig.10 80μmol/L group，the apoptotic peakbecame more obvious

图11 ICT对EL-4细胞凋亡相关基因 mRNA表达的影响Fig.11 The effect of ICT on the expression ofmRNA of apoptosis-related gene of EL-4 cells

2.4 ICT对EL-4细胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影响

经40μmol/L、80μmol/L的 ICT处理 EL-4细胞6 h后 Caspase-3与 Caspase-9酶活性明显提高（表3、图12）。

3 讨论

有研究表明，ICT具有雌激素样活性［3］，并可诱导小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞［4］；增强诱导的神经元细胞共表达神经元特异性微管蛋白（βtubulin III）和胆碱乙酰基转移酶［5］。近年来，其抗肿瘤作用备受人们关注。文献表明ICT可通过G1期阻滞抑制前列腺癌细胞的增殖［1］，具有一定的抗肿瘤活性。但其对淋巴瘤的作用尚未见报道。

表3 不同浓度ICT对Caspase-3与Caspase-9酶活性的影响Tab.3 The effect on the enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9 of ICT in different dose

图12 不同浓度ICT（μmol/L）对Caspase-3与Caspase-9酶活性的影响Fig.12 The effect on the enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9 of ICT in different dose

本研究将不同浓度的ICT与EL-4细胞共培养，采用 MTT比色法检测其对EL-4细胞生长的影响，结果显示在5～20μmol/L浓度范围内，ICT对EL-4细胞的生长产生明显的抑制作用，并且随着浓度的提高，作用时间的延长，抑制作用愈明显，呈时间和浓度依赖性。

细胞凋亡（apoptosis）是为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡的过程。细胞凋亡失常与肿瘤发生密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡对于肿瘤的治疗具有重大意义［6］。本研究采用流式细胞术分析发现，与对照组相比，实验组在二倍体峰的左侧出现明显的亚二倍体凋亡特征峰，且随着剂量的增加，凋亡峰也愈加明显，显示出剂量依赖性。在透射电镜下，可发现对照组很难见到凋亡细胞，而实验组则能观察到成片较多的典型的凋亡细胞，不仅能看到凋亡各个时期的表现，而且能看到大量凋亡小体。这些结果提示ICT能够诱导EL-4细胞的凋亡。

在此基础上，本实验进一步研究了ICT诱导凋亡的可能机制。

细胞凋亡受到各种凋亡调控蛋白的调控［7］。Bcl-2首先在人类滤泡性淋巴瘤中被确认，是发现最早的抗凋亡基因［8］，是细胞凋亡的重要调节者。这一家族的某些成员为凋亡激动蛋白（如 Bax，Bak，Bcl-xs，Bad，Bid等），而另一些成员则为凋亡拮抗蛋白（如Bcl-2，Bcl-XL，Bcl-w等）。我们的研究结果显示ICT能使 EL-4细胞Bcl-2 mRNA表达下调，提示Bcl-2参与了ICT诱导EL-4细胞发生凋亡的过程。

P21蛋白最初被认为是一种能引起细胞周期停滞的细胞周期调控蛋白，在药物诱导的肿瘤抑制中起重要作用。近来，大量研究表明根据细胞类型及微环境不同，P21既有促凋亡作用，也有抑制调亡作用［9］。其阻止凋亡作用的机制可能与 Caspase-3介导的 P21裂解使 cyclinA/CDK2活性改变有关。Adachi等［10］研究发现缺氧可增加 Caspase-3活性，裂解P21，使其表达下降而致cyclinA/CDK2活性上调，引起细胞凋亡。本实验发现，ICT作用EL-4细胞后，P21 mRNA表达下调，提示P21可能参与EL-4细胞凋亡的过程。

Caspase家族是一类蛋白水解酶，在细胞内以无活性的酶原形式存在。是执行凋亡的主要酶类，绝大部分细胞凋亡依赖于其存在［11］。通常认为Caspase-9属于凋亡起始组，而 Caspase-3是凋亡的主要执行者，属于凋亡效应组。一旦被激活，起始Caspase即转活化其他 Caspase酶原，引起级联激活效应，导致细胞凋亡［11］。激活的 Caspase-3作用于底物PARP，使之发生水解，其水解产物促进细胞骨架降解和 DNA片断化［12］。本研究通过比色法Caspase-3、Caspase-9酶活性检测显示 40μmol/L ICT能够显著增强 EL-4细胞 Caspase-3酶活性，也可同时增强Caspase-9酶活性，可能是促进 EL-4细胞的凋亡的因素之一。

综上所述，ICT体外可有效抑制EL-4细胞的生长，并诱导其细胞凋亡。考虑其作用可能通过下调bcl-2、P21 mRNA表达，激活Caspase-3、Caspase-9蛋白等途径实现的。

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