聚乙二醇修饰多壁碳纳米管对质粒DNA的影响

劳文艳， 商迎辉， 焦 正， 劳凤学

(1.北京联合大学北苑校区，北京100012;2.上海大学环境与化学工程学院，上海200444)

随着纳米技术的发展，碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)的用途越来越广［1-6］，与科研人员和普通大众的接触也越来越多.因此，在CNTs基材料广泛应用之前，深入彻底地研究其健康与安全问题非常有必要.CNTs或含CNTs复合材料的生物相容性研究已经成为CNTs研究领域的一个新热点.Webster等［7］研究了一系列复合材料 polyurethane (PU)/CNTs和星状细胞的关系，并发现随着CNTs含量的提高，材料中的星状细胞量减少，并且阻碍了星状细胞的增殖.Hu等［8］和Gabay等［9］的研究结果显示，经聚乙烯亚胺化学修饰后的CNTs对神经细胞生长有促进作用.Supronowicz等［10］发现，导电复合材料polylactic acid(PLA)/MWNTs通过交流电击能够明显提高造骨细胞的增殖速度.

DNA是生物体中一类最基本的大分子，是遗传信息的原初载体，是细胞生长、发育、繁殖和遗传的重要物质基础.研究由纳米材料所导致的DNA结构和功能的变化，有利于从微观角度理解纳米材料的生物相容性本质，从而为探讨和解决宏观领域中的实际问题提供依据.本研究通过电泳实验和原子力显微镜观测，分析多壁碳纳米管(MWNTs)和PEG修饰MWNTs与质粒DNA的作用情况，并从二者对质粒DNA损伤的角度考察了MWNTs的生物相容性.

1 实验

本实验中使用的MWNTs直径为10～30 nm，长度为5～50 μm，购自深圳市纳米港公司.本实验采用混酸氧化法纯化MWNTs，用V(浓硝酸)∶V(浓硫酸)=1∶3的混合酸超声处理MWNTs，通过离心分离和真空干燥，得到的黑色固体为纯化MWNTs.PEG修饰MWNTs的合成方法为如下：取干燥的50 mg纯化MWNTs，加入15 mL pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，超声分散均匀，加入 200 mg的碳二亚胺与250 mg N-羟基琥珀酰亚胺，超声30 min，再加入500 mg PEG-1500，置于磁力搅拌器上室温搅拌24 h，反应后的溶液用水洗涤，12 000 r/min离心分离30 min，得到的固体用去离子水洗涤后再用0.22 μm的纤维素微孔滤膜真空过滤，得到PEG修饰MWNTs.原始MWNTs、纯化MWNTs和PEG修饰MWNTs的透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)照片如图1所示.

本实验中所使用的其他试剂均为分析纯.实验采用碱法抽提质粒DNA，所用质粒为pGBKT7，大小约为7.3 kb.MWNTs经超声振荡后与DNA混合形成混合溶液，然后进行凝胶电泳实验.取9 μL样品加入1 μL的loading buffer(染色剂)混合均匀，按照由高到低的浓度顺序，用移液枪依次在每个孔中注入样品、质粒和loading buffer的混合物，最后加入水、质粒和loading buffer的混合物作为对照.电泳实验电压设定为120 V，时间设定为50 min.

使用天能凝胶成像系统对电泳结果进行凝胶成像，应用凝胶成像系统的分析软件对凝胶中不同形态DNA的光密度进行定量分析，从而得到不同质量浓度下MWNTs对质粒DNA的损伤情况.

使用岛津公司的SPM-9600AFM观察MWNTs对DNA的作用.对质粒DNA进行成像时，AFM采用如下的制样方法.在室温下，将250 μg/mL的原始WMNTs、纯化WMNTs和PEG修饰MWNTs与DNA溶液混合(质粒DNA终质量浓度控制在250 ng/mL左右)，涡旋震荡器上恒温(25℃)轻轻震荡24 h.用移液枪吸取5 mL的MWNTs与质粒DNA的混合液，缓缓滴于3-氨基丙基三乙氧基硅烷-云母衬底上，随后用干净平整的封口膜轻轻覆盖在液滴上，并使溶液均匀地平铺在衬底上.将衬底静置几分钟后揭去封口膜，吸取少量的去离子重蒸水冲洗衬底面，重复冲洗若干次以便去除未吸附的质粒.最后，将冲洗后的衬底置于阴凉干燥处，使残留在衬底上的水分自然风干，样品制备完毕.由于是测试生物样品，扫描速率要尽量放慢在0.5 Hz左右，振源幅度要尽量调低，设置点调高，确保在成像时，AFM的针尖以较小的力拍击样品表面，从而不会对样品产生破坏.

2 结果与讨论

2.1 电泳实验结果与讨论

图1 MWNTs的TEM图Fig.1 TEM images of MWNTs

本实验选择体外评价方法(plasmid DNA assay)对MWNTs以及PEG修饰MWNTs的生物活性进行研究.在纳米材料对DNA的损伤过程中，最初的损伤表现为超螺旋DNA松弛(relaxed)，进一步的损伤表现为DNA的线化(linearized).正常的质粒DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度比松弛和线化的DNA快，故在智能凝胶成像系统所生成的图像中能够得到3条明显分开的条带(见图2).通过对图2进行分析，可以定量检测不同的纳米材料对质粒DNA超螺旋部分的损伤程度［11］，并由此对纳米材料的生物相容性作出相应的评价.

图2 不同质量浓度的MWNTs对质粒DNA损伤的凝胶成像结果(μg/mL)Fig.2 Gel images of plasmid DNA damage by various concentration of MWNTs(μg/mL)

图3为不同质量浓度的CNTs对质粒DNA损伤情况的定量分析结果.可以看出，当原始单壁碳纳米管 (single-walled CNTs，SWCNTs)质量浓度为125 μg/mL时便开始损伤质粒DNA，并且随着质量浓度的增加，损伤程度也逐渐增加;当质量浓度达到2 000 μg/mL时，对质粒DNA的损伤已非常明显，可达48.6%.纯化MWNTs对质粒DNA的损伤较原始SWCNTs稍有减弱，低质量浓度范围内的纯化MWNTs对质粒DNA超螺旋部分的损伤百分比处于一个较低的水平;但当质量浓度达到2 000 μg/mL时，纯化MWNTs对质粒DNA超螺旋部分的损伤也达到了21.1%，表明原始SWCNTs和纯化MWNTs在达到一定质量浓度时，对质粒DNA都有较为明显的损伤.而PEG修饰MWNTs对质粒DNA的损伤明显减弱，其损伤百分比一直处于一个非常低的水平;当质量浓度达到2 000 μg/mL时，PEG修饰MWNTs对质粒DNA超螺旋部分的损伤也只有13.6%.

2.2 AFM实验结果与讨论

AFM在生物结构的研究中具有如下独特的优势：①可在纳米水平上分辨生物大分子的结构信息;②具有直观的三维表面信息;③样品制备相对简单，无需进行染色、包埋等复杂处理过程;④可深入了解单个生物分子的三维结构变化.越来越多的研究者利用AFM来研究DNA的结构变化.Pang等［12］利用AFM研究了电子辐射导致水溶液中DNA断裂的情况.Zhu等利用AFM观测了Zn2+导致DNA扭曲的现象.本实验利用 AFM分别观测了纯pGBKT7质粒结构以及原始MWNTs、纯化MWNTs和PEG修饰MWNTs对质粒DNA结构的影响，结果如图4～图7所示.

图3 不同质量浓度的CNTs溶液中质粒DNA超螺旋部分的损伤情况Fig.3 Percentage of supercoiled DNA damage in CNTs solution at different mass concentration

图4为纯pGBKT7质粒DNA的AFM图像，可以清晰地看到，其完整的环状结构均匀地分布在云母片上，每个环状质粒的外径约为85 nm，高度约为2 nm.

图4 pGBKT7质粒DNA的AFM图像Fig.4 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA

图5为质粒DNA与原始MWNTs混合培养后的AFM图像.可以看出，未经纯化的原始MWNTs对质粒DNA的损伤非常严重，绝大多数质粒DNA失去了其完整的环状结构，即共价闭合环状质粒DNA发生链断裂变成了开环的质粒(open circular DNA，ocDNA)，还有一些质粒DNA发生了更为严重的断裂现象，即断裂成小段并形成线化 DNA(linear DNA，lDNA).

图5 pGBKT7质粒DNA与原始MWNTs混合培养后的AFM图像Fig.5 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with pristine MWNTs

图6为质粒DNA与纯化MWNTs混合培养后的AFM图像.可以看出，大部分质粒DNA保持了原有的完整环状结构，在与原始MWNTs共同培养过程中出现的共价闭合环断裂现象已经得到了明显的改善，线化的质粒DNA较少，但质粒DNA出现了扭曲现象，DNA间的纠结、缠绕现象也较为严重.由图6可以明显地看到，质粒DNA在云母片上的分布不均匀，大量的质粒DNA团聚成一簇.

图6 pGBKT7质粒DNA与纯化MWNTs混合培养后的AFM图像Fig.6 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with purified MWNTs

图7为质粒DNA与PEG修饰MWNTs混合培养后的AFM图像.可以明显地看出，大部分的质粒DNA完整地保存了其环状结构，基本上未出现开环、线化和团聚的现象，绝大多数环状质粒DNA均匀地分布在云母片上.AFM图像中出现的管状结构为PEG修饰MWNTs，点状结构为质粒DNA，它们均匀地分布在云母片上，结构非常完整.

图7 pGBKT7质粒DNA与PEG修饰MWNTs混合培养后的AFM图像Fig.7 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with PEG-MWNTs

通过AFM的剖面分析观测，可以发现与各种MWNTs混合培养之后，质粒DNA的外径都有不同程度的收缩，纯的质粒DNA的直径为80～90 nm，平均直径约为85 nm.纯化MWNTs与质粒DNA共同培养后，质粒DNA的收缩情况比较明显，平均直径收缩至50 nm左右.PEG修饰MWNTs与质粒DNA共同培养后，质粒DNA的收缩情况不明显，平均直径在75 nm左右.利用AFM中的长度分析软件，对每种外径的缩小情况统计40个质粒DNA，结果如表1所示.

表1 pGBKT7质粒DNA与纯化后的MWNTs，PEG修饰WMNTs混合培养后外径测量Table 1 Outer mean diameters for ringlike plasmid DNA incubated with purified-MWNTs and PEG-MWNTs measured by AFM

AFM观测得到的结果与电泳实验所得到的结论非常吻合.未经纯化处理的原始MWNTs对质粒DNA的损伤较为严重，原因可能是原始MWNTs中含有的包括铁、钴、镍等金属颗粒杂质对质粒DNA产生了损伤.经过纯化的MWNTs，由于金属催化剂和大部分的杂质颗粒被除去，因而对质粒DNA的损伤有所减弱，不会造成质粒DNA的断裂，但质粒DNA发生了收缩和扭曲现象.经过 PEG修饰的MWNTs，由于其表面包裹了一层溶解性良好的高分子材料，体现出较好的生物相容性.其对质粒DNA的损伤非常小，不会造成质粒DNA的断裂和扭曲，基本完好地保持了原有的形态.

3 结束语

Plasmid DNA assay的研究结果表明，就对质粒DNA的损伤程度而言，原始MWNTs＞纯化MWNTs＞PEG修饰MWNTs.PEG修饰MWNTs具有较好的生物相容性，当质量浓度达到2 000 μg/mL时，PEG修饰MWNTs对质粒DNA超螺旋部分的损伤也只有13.6%;而在相同质量浓度下，原始MWNTs和纯化MWNTs对质粒 DNA超螺旋部分的损伤分别为48.6%和21.1%.

AFM观察的结果和plasmid DNA assay的结果非常吻合.原始MWNTs能够造成大量的质粒DNA分解、断裂成线状.纯化MWNTs对质粒DNA的形貌损伤有所减弱，大部分质粒DNA保持了原有的环状结构，但质粒DNA的收缩、团聚和缠绕现象非常明显.PEG修饰MWNTs对质粒DNA形貌的影响最弱，绝大多数质粒DNA完好地保持了原有的环状结构，质粒的收缩现象不明显.

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