缺氧缺血性脑损伤后针康法对幼鼠学习记忆能力及海马微管相关蛋白-2表达的影响

孔妍,唐强,,朱路文,刘波

缺氧缺血性脑损伤后针康法对幼鼠学习记忆能力及海马微管相关蛋白-2表达的影响

孔妍1,唐强1,2,朱路文1,刘波2

目的探讨针康法对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)幼鼠学习记忆能力及海马微管相关蛋白-2(M AP-2)的影响。方法将80只Wistar幼鼠随机分为5组:假手术组、模型组、头穴丛刺组、环境刺激组和针康组,每组 16只。每组再按造模后 14 d、28 d分别处死分为2个亚组,每组8只。采用结扎左侧颈总动脉,吸入氧体积浓度为8%的氧氮混合气体,制作HIBD新生动物模型。采用Morris水迷宫评价幼鼠学习、记忆能力,免疫组化法检测海马MAP-2阳性细胞的表达。结果水迷宫实验结果显示:模型组逃避潜伏期时间延长,穿台次数减少。在定位航行、空间探索能力方面头穴丛刺组、环境刺激组和针康组与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。在定位航行、空间探索能力方面针康组分别与头穴丛刺组、环境刺激组比较有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化检结果显示:头穴丛刺组、环境刺激组、针康组海马 CA1区MAP-2的表达均多于模型组(P＜0.05),海马CA1区 MAP-2表达针康组较头穴丛刺组、环境刺激组表达增加(P＜0.05)。结论针康法能提高HIBD幼鼠学习记忆能力,其分子机制可能与海马CA1区MAP-2阳性细胞的表达水平增加有关。

缺氧缺血性脑损伤;针康法;微管相关蛋白-2;大鼠

围产期胎儿窒息引起的缺氧缺血性脑损伤最终可导致缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE),迄今为止尚无理想的治疗方法。针刺结合康复训练可以提高脑瘫患儿的日常生活活动能力(activities of daily living,ADL)和爬行能力[1],减少患儿神经系统后遗症的发生率或减轻后遗症的严重程度[2]。本研究旨在通过建立缺氧缺血性脑损伤模型,探讨针康法治疗缺氧缺血性脑损伤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 7日龄新生Wistar幼鼠(由长春动物实验中心提供),雌雄不限,体重11～15 g。随机分为5组:假手术组、模型组、头穴丛刺组、环境刺激组和针康组,每组16只。各组再按造模后14 d、28 d分为2个亚组,每组8只。

1.2 主要仪器及试剂 Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司),低氧混合气(8%O2+92%N2)(哈尔滨卿化气体有限公司),LEICA RM-2135轮转式切片机(德国制造),光学显微镜BH-2型(日本OLYMPUS公司),华佗牌毫针(中国苏州医疗用品厂),免疫组化试剂盒(北京中杉生物技术公司)。

1.3 模型的制备 乙醚麻醉状态下,剪开皮肤及皮下组织,分离左侧颈总动脉,并用0号丝线双结扎,术后动物回母鼠笼恢复2 h,置于37℃有机玻璃缺氧箱中,持续充以气流量为0.5 L/min的8%氧氮混合气体2 h。建模后出现夹尾左旋者纳入实验。假手术仅切开大鼠颈部皮肤并暴露左侧颈总动脉,不结扎,缝合皮肤后也不予缺氧处理。结束后放回母鼠笼中喂养。

1.4 丰富环境(enriched environment,EE)笼和有机玻璃缺氧箱的制作

1.4.1 丰富环境笼 参照文献[3]自行设计,为70×60×50 cm的大笼,笼内放置不同颜色、形状及气味的物体,包括各种质感的砂纸、毛刷,冰冷的金属和有刺激性气味的柠檬、薄荷、棉球,还有转盘、管道、斜坡、秋千、跷跷板、小球等“玩具”。

1.4.2 有机玻璃缺氧箱 自制30×30 cm上下各有1个0.5×0.5 cm小孔的容器。上孔通混合气体,下孔与外界相通,以保持容器内压力与大气一致及持续低氧状态。箱底层有钠石灰吸收舱内水分和CO2。

1.5 干预方法 ①假手术组:术后将幼鼠置于普通母鼠笼中饲养;②模型组:术后另置普通母鼠笼中饲养,不予以任何治疗;③头穴丛刺组:术后24 h后进行头针治疗,采用丛刺法,按照“大鼠穴位图谱”[4]所示,取百会穴及百会左、右侧各旁开2 mm处针刺,快速捻转1 min后留针2 h,每天1次;④环境刺激组:术后24 h开始给予丰富环境刺激。每天将仔鼠与母鼠分离放入丰富环境笼内2 h。同时配明暗红色灯光刺激及舒缓的轻音乐。干预过程中每周将环境改变两次,以造成新异的刺激。⑤针康组:术后24 h开始予以头穴丛刺后放入丰富环境笼中给予环境刺激2 h,之后拔针放回母鼠笼中,每天1次。

1.6 学习记忆能力评估 Morris水迷宫为一直径150 cm、高50 cm的圆形水池,外接动态轨迹摄像和计算机分析系统。水深30 cm,水温保持在(24±2)℃,水中加全脂淡奶粉160 g使水浑浊。在水池边缘确定东、南、西、北4个点,在水池中间设立一个直径9 cm、高29 cm的透明有机玻璃平台,没于水下1 cm。测试时室内安静,物品陈设、照明度一致。各组幼鼠在术后14 d、28 d分别进行Morris水迷宫测试,每天上、下午各1轮,每轮4次,2次训练间隔30 s,每次分别从4个象限1/2弧度处头朝壁入水,在60 s内触到平台的时间为逃避潜伏期。若大鼠在60 s内未找到平台,则以60 s计。以最后1 d 4次所用时间的总平均值作为观察指标。逃避潜伏期短说明实验成绩好。共5 d。第5天下午撤除平台,大鼠于原平台对侧象限入水,观察其60 s内穿越原平台所在位置的次数(穿台次数),测4次取其平均值。穿台次数多说明实验成绩好。

1.7 标本制备 各组大鼠于术后14 d、28 d分别取出8只,在麻醉状态下,开胸暴露心脏,先用9 g/L盐水200 ml经左心室快速冲洗之后,再用40 g/L多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制,pH 7.4)400 ml灌流固定。取脑后置于40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h,将固定好的脑组织用石蜡包埋,从视交叉的水平进行冠状切片。

将载玻片防脱片剂处理,切片脱蜡至水。蒸馏水新鲜配置3%H2O2,室温水洗3次。过氧化氢浸泡10 min。蒸馏水洗3 min×3次。微波修复。PBS冲洗3 min×3次。滴加稀释的一抗30 min。PBS冲洗3 min×3次。滴加稀释的二抗30 min。PBS冲洗3 min×3次。DAB显色,苏木红轻度复染。脱水、透明、封片。采用OLYMPUS光学显微镜观察,每张切片不同部位400×目镜下选3个视野,观察阳性细胞数目。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,组间均数差异的比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 学习记忆能力的评估 水迷宫实验结果显示,各时间点模型组逃避潜伏期时间延长,穿台次数减少。头穴丛刺组、环境刺激组和针康组与模型组比较,逃避潜伏期时间缩短,穿台次数增加(P＜0.05)。针康组与头穴丛刺组、环境刺激组比较,逃避潜伏期时间缩短,穿台次数增加(P＜0.05)。见表1和表2。P=0005;与模型组相比,c:t=2.937,P=0.015;d:t=2.820,P=0.017;e:t=2.915,P=0.013;f:t=2.813,P=0.015;与头穴丛刺组相比,g:t=4.317,P=0.012;i:t=4.221,P=0.010;与环境刺激组相比,h:t=4.215,P=0.013;j:t=4.112,P=0.010。

表1 逃避潜伏期(s)

表2 穿台次数

2.2 免疫组化检测海马CA1区微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达 免疫组化检结果显示,各时间点,头穴丛刺组、环境刺激组、针康组海马CA1区MAP-2的表达均多于模型组(P＜0.05),海马CA1区MAP-2表达针康组较头穴丛刺组、环境刺激组表达增加(P＜0.05)。

组别 n 14 d 28 d

表3 各组大鼠不同时间点海马CA1区MAP-2阳性细胞数目

3 讨论

近年来,环境康复疗法干预发育期脑损伤日益得到人们的重视。临床研究证实,早期丰富环境干预有利于脑发育和脑功能的发挥,丰富环境刺激可增强中枢神经系统的突触可塑性,促进脑发育和脑损伤的修复[5]。头穴丛刺针法是于致顺教授创立的治疗脑性疾病的针法,具有“整体良性调整”作用,对机体可发挥多环节、多水平、多途径的调节作用[6]。

神经细胞可塑性是学习记忆的基础。学习记忆功能依赖于完整的神经网络通路,神经突触是实现神经细胞间信息传递的特化结构,因而完整的突触结构和传递效能影响着复杂的学习记忆过程。大脑边缘系统特别是海马部位既是缺血缺氧的易损区,又是学习记忆的关键部位,海马CA1区损伤后必将引起脑发育过程中功能和行为的异常。

MAP-2是一种重要的细胞骨架蛋白,与神经可塑性密切相关[7]。MAP-2主要存在于中枢神经系统神经细胞胞体、树突、树突棘和突触后致密区,与突触后膜上一些信号蛋白和膜受体相连,是许多神经信号传导通路的底物,调节神经元突触可塑性以及细胞骨架动力学、对树突的延伸和分支起重要作用[8]。近年来MAP-2免疫活性下降在脑损伤中的作用日益受到重视[9],被认为是脑缺氧缺血后神经细胞受损及再生指标之一。

本实验结果表明,模型组海马CA1区MAP-2表达较假手术组明显减少,免疫阳性染色产物呈串珠样排列,提示缺氧缺血后神经元受到损伤,MAP-2磷酸化障碍,微管的不稳定性增强,微管聚合作用下降,这样必然会导致细胞骨架完整性遭到破坏、树突崩溃,发育停止,突触连接中断,突触结构和功能受到影响。给予头穴丛刺、丰富环境、针康法干预后,海马CA1区MAP-2的表达均增高,提示存在神经细胞再生、突触重塑,表明早期干预对大鼠海马CA1区有保护作用,可以促使树突生长和受损细胞结构恢复,增强神经可塑性。提示海马CA1区MAP-2蛋白可能参与了头穴丛刺、环境刺激、针康法对HIBD神经可塑性的影响。

本次实验还发现,HIBD幼鼠进行针康法干预后,水迷宫试验评定学习记忆能力较头穴丛刺组、环境刺激组改善(P＜0.05)。海马CA1区 MAP-2蛋白表达,针康组与头穴丛刺、环境刺激组比较有显著性差异(P＜0.05)。学习记忆能力改善与海马CA1区MAP-2蛋白表达增加相一致,提示针康法促进局灶性脑缺血大鼠学习、记忆的改善,可能与海马CA1区MAP-2蛋白表达增加有关。针康法有望成为临床治疗HIBD及减轻脑损伤后遗症的经济、无创、无痛苦的有效方法。

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Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Learning and Memoryand Expression of Hippocampus Microtubule-associated Protein-2 in Young Ratsafter Hypoxic Ischemic Brain Damage

KONGYan,TANGQiang,ZHU Lu-wen,et al.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,Heilongjiang,China

ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on learning and memory and the expression of hippocampus microtubule-associated protein-2(MAP-2)in young rats after hypoxic ischemic brain damage(HIBD).Methods80 Wistar young rats were randomly divided into 5 groups:sham group,model group,scalp cluster acupuncture group,environmental stimuli group,and acupuncture with rehabilitation group,16 rats in each group.Each group was divided into 2 subgroups on the 14th and 28th days after the model.HIBD young animal model was made by ligating left common carotid artery and inspiring 8%oxygen and 92%nitrogen mixture.Learning and memory was observed by Morris water maze,and M AP was observed by immunohistochemistry.ResultsThe results of the Morris water maze test showed that there was significant difference in ability of place navigation and space exploration in the scalp cluster acupuncture group,the environmental stimuli group,and the acupuncture with rehabilitation group compared with the model group(P＜0.05),and there was significant difference in ability of place navigation and space exploration in the acupuncture with rehabilitation group compared with the scalp cluster acupuncture group and the environmental stimuli group(P＜0.05).The results of immunohistochemistry showed that there was significant difference in the expression of M AP-2 in the scalp cluster acupuncture group,the environmental stimuli group,and the acupuncture with rehabilitation group compared with the model group(P＜0.05),and there was significant difference in the expression of MAP-2 in the acupuncture with rehabilitation group compared with the scalp cluster acupuncture group and the environmental stimuli group(P＜0.05).ConclusionLearning and memory of young rats after hypoxic ischemic brain damage can be improved by Tang's Approach which is possibly related with expression of MAP-2 in hippocampus.

hypoxic ischemic brain injury;Tang's Approach;microtubule-associated protein-2;rats

[本文著录格式]孔妍,唐强,朱路文,等.缺氧缺血性脑损伤后针康法对幼鼠学习记忆能力及海马微管相关蛋白-2表达的影响[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):310—312.

哈尔滨市科技创新人才研究专项基金项目(RC2009QN004143)。

1.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨市 150040;2.黑龙江中医药大学附属二院康复医学科,黑龙江哈尔滨市150001。作者简介:孔妍(1983-),女,黑龙江哈尔滨市人,2010级博士研究生,主要研究方向:小儿脑瘫的康复。通讯作者:唐强(1963-),男,教授,博士生导师,主要从事神经系统疾病中医康复方法研究。

R245,R49,R743.3

A

1006-9771(2011)04-0310-03

2011-03-16)

·专题·