一种改进的非人灵长类神经功能缺损评价方法

朱 华，卢 珊，冯 铭，李 秦，刘 颖，代小伟，安沂华，赵春华，王任直，秦 川

(1.中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，

国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021；2.中国医学科学院实验动物研究所motac合作实验室，北京 100050；

3.中国医学科学院北京协和医院，北京 1000730；4.中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005；5.北京神经外科研究所，北京 100050)

动物模型是研究脑血管疾病损伤机制和防治措施必不可少的工具。评价量表在监测临床脑卒中病情变化、疗效判断、预测结局及大样本临床试验研究中起重要作用。目前为止国际上尚无一个公认的可用于多中心临床研究的脑卒中评定量表，与之相关的灵长类脑卒中动物模型及神经行为评价方法更是缺乏，严重影响了临床科研资料的可比性。针对这个问题，在进行食蟹猴脑出血模型制作及干细胞治疗的研究过程中，我们对目前灵长类脑卒中模型评价中常用的KITO［1］量表进行修改和细化后对实验猴的神经功能进行了动态量化观察，使其更适于灵长类脑卒中神经功能缺损的评价。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年雄性食蟹猴12只，购自军事医学科学院实验动物中心，年龄4～6岁，体重4.2～4.5kg。

1.2 脑出血模型的制作

使用自体股动脉抗凝血脑内注射方法建立脑出血模型，见参考文献［2］

1.3 干细胞治疗

1.3.1 动物分组：12只动物分为模型对照组、高剂量组、低剂量组，分组的原则是各组动物间体重没有显著性差异。各组剂量见下表。

1.3.2 细胞注射：细胞为250μL的无色悬液，2个移植途径，每个移植路径分3个点注射，每点移植量为40μL，细胞数约6.7×105，移植速度10μL/min。对照组：等体积生理盐水。

1.4 神经功能评分

原始评价量表来源于文献1，在原表格基础上进行细化修改。其中意识28分，感觉系统22分，运动系统32分，骨骼肌共济协调18分共100分。造模后6h，1d，3d，1w及干细胞注射后1d，3d，1w，2w，3w，4w在每天的固定时间使用文献中的表格和改进的表格同时进行评分。表中的“威逼”刺激特指使用钝头钢条轻轻接触或试图接触动物。没有任何捅、刺、扎、拨、挑等的强制外力施加于动物。声音刺激特指使用钝头钢条轻轻敲击动物笼具发出的70db左右的金属碰撞声。接触刺激特指使用毛刷轻轻接触动物肌肤。除轻微的扫刷力量外，没有其他任何强制外力施加于动物。所有评分由同一名有经验的评价者完成。

表1 人骨髓间充质干细胞移植治疗食蟹猴脑出血实验分组Tab.1 The grouping of the animal

表2 改进的神经功能评价表Tab.2 The proved neurological deficit scale

续表

1.5 数据处理

使用SPSS13.0软件进行数据分析，统计方法采用相关性分析，单因素方差分析，P＜0.05时认为有显著性差异。

2 结果

造模手术前，所有动物的行为表现均正常，神经功能评分为0。造模手术后6h，动物在麻醉苏醒后均出现了与血肿部位相对应的神经系统定位体征。主要表现为有意识但情绪低落，对刺激不反抗。受到威逼刺激能够行走，但攀爬困难。对脚趾疼痛有弱的、不完全的、不协调的收缩反应。左前肢出现明显的麻痹，失去运动能力。用修改前后的表格评分均为31分左右。但从术后24h开始出现评分上的差异。随着时间的推移这种差异更加明显。干细胞注射前将动物进行随机分组后，用原表格评价的分数各组之间虽然没有统计学上的显著性差异，但低剂量组的分数比高剂量组和模型组低且标准差较大。改进表格统计的数据较平均，因此在注射干细胞后采用改进的表格进行评分。结果显示干细胞注射后1周开始到动物被安乐时，剂量组与对照组之间的神经功能评分出现显著性差异(p＜0.05)。高、低剂量组间未见显著性差异。

3 讨论

脑卒中临床神经功能缺损程度评分标准在治疗预后评估方面有很好的参考价值。临床医师根据长期临床经验，提出好的脑卒中评定量表应满足以下标准［3］：1、量表应包括足够的神经功能缺损评定项目，而且包含的项目对结局有预测性；2、量表的重测信度和评定者间信度好，内部一致性好；3、量表应敏感，评分要覆盖神经功能缺损的整个范围；4、使用方便，使用者易掌握，整个评定时间最好不超过14min。为了评分的可信性应该只包括定义明确、容易评分的项目；但为保持量表整体的敏感性，量表中应包括能体现各种脑卒中类型的项目。这两者之间就存在着矛盾。所以在制订脑卒中评定量表时应全面考虑综合分析。虽然灵长类动物大脑的构筑、白质与灰质的比值及微血管网络的分布区域与人类似，但种系发生上的差异使评价灵长类动物的神经功能缺损不能简单的平移临床量表［4，5］。可准确反映灵长类神经功能缺损的量表必须根据灵长类动物的特点结合临床指标而设计［6］。我们之所以已Kito的表格为基础进行改进主要原因有以下几点：1、评分表的格式采用的是临床常用的glasgow昏迷评分，比较直观。2、内容设置比较全面合理：评分包含4各方面：意识、骨骼肌协调、感觉系统和运动系统。其中前3项既与临床相关，是临床评分表格中的必备项目，又体现了动物野外生存应对外界危机各种刺激的反应能力。在运动功能的检查项目中，首先是将前后肢分开进行评价，因为猴的前肢功能在进化过程中基本独立出来，主要用于抓握和攀爬等，前肢功能损伤会严重降低动物的野外生存能力。另外在每个分项目均有反映肢体麻痹的内容，并把左右前肢分开评价。我们的实验也证实造模手术主要影响动物对侧上肢的感觉运动功能，同侧则几乎不受影响。因而把左右前肢分开评价非常必要。

表3 造模及干细胞治疗前后神经功能评分结果Tab.3 Neurological deficit score after stroke and human mesenchymal stem cell transplantation

感觉和反射功能在神经功能评价中占有很重要的地位，但往往因为无法准确检查而不被包括在检查项目中。原表格中虽然对深浅感觉和各项反射功能进行了列项，但评价标准比较模糊，而且每个条目之间分差较大，当动物症状不明显时量表的敏感性减低。即损伤程度越轻，改进表格与原表评分结果之间的差异越显著。我们的评分结果也证实了这一点：术后3d即症状最严重的时期，两个评分表间的差异不显著。从术后7 d开始两种评分方法出现了统计学上的差异。

改进的表格对原表格所列条目进行了逐级细化；对给与动物的刺激进行分类并对每种刺激明确定义，使评价者易于掌握和准确打分。这样即使是神经功能的细微恢复(如由表现为手指抓握时持续翘趾的中度痉挛和无力到偶尔翘趾的轻度痉挛和无力)也能表现出来。而正是这些细微功能对于动物的整体神经功能恢复评价具有重要作用。

灵长类脑卒中模型能较好的模拟人类脑血管疾病，但因涉及动物伦理、实验成本等原因使用较少，更缺乏标准的模型制作方法和神经功能评价方法。改进的量表在原表格包括运动、感觉和反射功能等信息的基础上，对原有条目进行细化和规范，克服了旧表格中分差大，评价标准模糊的缺点，即使动物的行为学症状不明显时也能评价出差异，使量表的敏感性大为提高。改进的量表可信度增高、可实施性增强，具有良好的临床相似性和可操作性。为建立标准化神经功能功能评价量表进行了有益尝试。

［1］Kito G，Nishimura A， Susumu T， et a1. Experimental thromboembolic stroke in cynomolgus monkey［J］.J Neurosci Methods，2001，105(1)：45-53.

［2］朱华，李秦，冯铭，等.食蟹猴脑出血模型的建立及评价［J］.中国比较医学杂志.2009，19(7)，29-32.

［3］Hantson L，DeWeerdt W，DeKeyser J，et al.The European stroke Scale［J］.Stroke，1994，25：2215-2219.

［4］Ben R，Naimath K，Eray T，et a1.Chronic ischemic stroke model in cynomolgus monkeys：behavioral，neuroimaging and anatomical study［J］.Neurol Res，2003，25(1)：68-78.

［5］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of cognitive and motor deficits in a marmoset model of stroke［J］.ILAR J，2003，44(2)：153-160.

［6］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of functional impairment following permanent middle cerebral artery occlusion in a nonhuman primate species［J］.Neurodegeneration，1996，5(3)：275-286.