心脏特异表达人源FAM55A转基因小鼠的建立

(中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

扩张型心肌病是一种以心腔(左心室和/或右心室)扩张、心肌收缩功能受损为主要特征的原因不明的心肌疾病［1］，是除冠心病和高血压以外导致心力衰竭的主要病因之一，5年内病死率高达15%～50%。

本室建立了心脏特异表达 cTnTR141W转基因小鼠，cTnTR141W转基因小鼠全心扩大，室壁变薄，间质纤维化，心肌收缩功能失调［2］，表现出典型的扩张型心肌病病理表型。

FAM55A(fam ily with sequence similarity 55member A)是一个假说基因，基因功能仍有待于研究。cTnTR141W疾病模型动物心脏全基因表达芯片结果显示，FAM55A在扩张型心肌病动物模型心肌中mRNA表达上调，本实验还发现 cTnTR141W扩张型心肌病小鼠心脏中FAM55A蛋白表达显著高于比野生型小鼠，推测FAM55A可能是心肌病发生发展中的修饰基因之一。因此，本研究建立心脏特异人源FAM55A转基因小鼠，以对该基因的功能及其对心肌病的影响进行初步探索。

1 材料和方法

1.1 FAM 55A表达载体的构建及转基因小鼠的制备

以pCMV-SPORT6-FAM55A质粒(Open Biosystems，美国，Clone ID5186472)为模板，PCR扩增小鼠FAM55A全长cDNA，上、下游引物分别为5'-GTCGACCTGAGGGCCAGGATGTCCTCC-3' 5'-GTCGACATCCCTTAGCAAATGTAGTTTAAGAAC-3'，引物5'端均带有SalI酶切位点(带下划线)，目的基因FAM55A为1235bp。将扩增片段插入pMD18T载体，经测序并比对正确无突变碱基后，以SalI (宝生物工程有限公司，中国)酶切回收 FAM55A片段，并克隆入 α-MHC启动子［Genbank Accession no.U_71441(clone 26)］下游构建心脏特异人源FAM55A表达载体，用 NotⅠ(宝生物工程有限公司，中国)将其线性化，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到 C57BL/6J小鼠(康蓝公司［SCXK (京)2004001］)的受精卵中，用ICR小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK(京)2006-0009］)作假孕受体，制备转基因小鼠(TE2000U显微注射仪)［3］。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准(GC-08-2031)。

1.2 PCR鉴定FAM 55A转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生9～14d用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组 DNA［4］，用PCR法对转基因小鼠进行基因型检测。αMHCFAM55A转基因小鼠PCR引物序列如下，上游引物为：5'-CCTCCTGTCCCTGGTGGTT-3'，下游引物为：5'-CGATGGCCCTGCGAATAA-3'(上海生物工程技术有限公司，中国)。反应条件为：94℃预变性 5m in，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环。琼脂糖电泳分析PCR产物，目的产物FAM55A片段431bp。

1.3 Western Blot检测FAM 55A的表达

提取3月龄野生对照小鼠和cTnTR141W转基因小鼠的心脏总蛋白；提取 F1代阳性转基因小鼠及同窝阴性小鼠的心脏总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白条带转移到0.45μm硝酸纤维素膜上，置于5%的脱脂奶粉封闭液中，室温1h，加入TBST稀释的鼠抗 FAM55A多克隆抗体(1∶500) (H00120400-B01，Novus Biologicals，美国)，4℃ 孵育过夜，用TBST洗膜三次，每次10min。然后加入1∶15000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温杂交1h。采用HRP-GAPDH(康成生物，中国)作为内参，弃去二抗，TBST洗膜三次，每次5m in，TBS洗膜一次，10min。将膜置于化学发光剂中，用X光胶片曝光。

1.4 超声检查FAM 55A转基因小鼠

选用不同月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠，饱和三溴乙醇麻醉，选用30Hz的探头，进行心脏超声影像分析［5］(Vevo770小动物超声探测系统，加拿

1.5 组织学检测

选用5月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠，颈椎脱臼法牺牲小鼠，打开胸腔取出心脏，将心脏组织固定在中性福尔马林中24h，进行脱水、包埋、切片，HE染色。

1.6 统计学分析

数据用SPSS统计软件处理。先进行数据的方差齐性检验，组间比较采用独立性t检验。计量数据用平均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 FAM55A在野生鼠和 cTnT转基因小鼠心脏中的表达

提取3月龄野生鼠和cTnTR141W转基因小鼠心脏组织总蛋白，Western blot分析FAM55A在心脏组织中的表达。结果显示，FAM55A在扩张型心肌病动物模型心肌中表达显著上调(图1)。

图1 FAM55A在野生鼠和cTnTR141W转基因小鼠心脏中的表达Fig.1 The expression of FAM 55A gene in the heart tissues of wild type mice and cTnTR141W transgenic mice注：分离3月龄野生鼠和cTnTR141W转基因小鼠的心脏组织总蛋白，GADPH作为内对照Note：The total lysates of heart tissues were isolated from the wild mice and cTnTR141W transgenic mice at 3months of age，the GADPH was used as normalization

2.2 FAM 55A的小鼠组织表达谱

提取3月龄野生鼠心、肝、脾、肺、肾、脑和睾丸组织总蛋白，Western blot分析FAM55A在各组织中的表达。结果显示，FAM55A于肺组织中表达最高，心脏、肝、脾、肾等组织中表达较少，脑和睾丸中表达最少(图2)。

2.3 FAM 55A转基因小鼠的建立

PCR扩增人FAM55A基因，插入PMD-18T载体测序，测序结果表明克隆的cDNA同已报道FAM55A序列完全一致(GenBank No.BC029049.1)，将 FAM55A基因插入心脏特异表达的α-MHC启动子的下游，构建FAM55A转基因表达载体(图3A)。用显微注射法将线性化的转基因表达载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入受体假孕 ICR小鼠中，小鼠出生14d提取基因组DNA，用PCR扩增FAM55A基因431bp目的片段，鉴定FAM55A转基因小鼠的基因型(图3B)，共得到5只首建鼠，且均可传代。分别提取FAM55A首建鼠的F1代阳性转基因小鼠和同龄阴性对照小鼠心脏组织总蛋白，用FAM55A多克隆抗体进行Western Blot分析，结果显示44号首建鼠心脏组织内 FAM55A蛋白表达量明显高于同龄阴性对照小鼠(图3C)。

图2 FAM55A在野生小鼠不同组织中的表达Fig.2 The expression of FAM55A gene in the tissues of wild type mice注：分离3月龄小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和睾丸组织的总蛋白，用Western blot检测FAM 55A基因在不同组织中的表达水平，GADPH作为内对照Note：The total lysates of heart，liver，sp leen，lung，kidney，brain，and testis tissues were isolated from the wild mice at3months of age.The expression of FAM 55A gene was detected by Western blot and the GADPH was used as normalization

2.4 超声检查FAM 55A转基因小鼠心脏的结构及功能

1、3、5月龄FAM55A转基因小鼠和同窝阴性小鼠进行心脏超声影像分析(表1)，结果显示，1月龄FAM55A转基因小鼠和同龄野生型小鼠相比，收缩期左室内径(LVID，s)增加了10%(P＜0.05，n= 12)，舒张期左室前壁厚度(LVAW，d)和收缩期左室前壁厚度(LVAW，s)分别增加了 29.5%和23.5%(P＜0.01，n=12)；3月龄转基因小鼠心脏射血分数(ejection fraction，EF)增加 6.7%(P＜0.05，n=12)，短轴缩短率(fraction shortening，FS)增加9.8%(P＜0.05，n=12)，舒张期左室前壁厚度(LVAW，d)和收缩期左室前壁厚度(LVAW，s)分别增加了28.2%和24.1%(P＜0.01，n=12)；5月龄FAM55A转基因小鼠射血分数和短轴缩短率相对于野生型小鼠无变化，舒张期左室前壁厚度(LVAW，d)和收缩期左室前壁厚度(LVAW，s)分别增加了14.3%和31.6%(P＜0.01，n=12)。

图3 FAM55A转基因小鼠的建立Fig.3 Generation of FAM55A transgenic mice注：A，FAM 55A转基因表达载体；B，基因型鉴定转基因小鼠PCR结果；M，DL2000；1～18，鼠尾DNA样品，共鉴定出3、7、16、17和18，5个阳性转基因小鼠。C，FAM55A在44#转基因小鼠心脏中的表达，以野生型(WT)为阴性对照小鼠，GAPDH加样一致性对照Note：A FAM55A transgenic expression construct.B Genotyping of FAM 55A transgenic mice detected by PCR.M DL2000DNA marker.1～18mice genom ic DNA samples.The totally 5founders were screened as shown in lanes of 3、7、16、17and 18.C was expression of FAM55Ain the 44#transgenic mice detected by western blot，and compared withthat of the wild type m ice control(WT).GAPDH was used as loading control

表1 1、3、5月龄野生型小鼠和FAM55A转基因小鼠M超声参数的独立样本t检验Tab.1 Independent samples t test of wild type and FAM 55A transgenic m ice at 1，3and 5months of age

2.5 FAM 55A转基因小鼠心脏病理学检查

将5月龄FAM55A转基因小鼠和同窝阴性对照小鼠的心脏进行病理解剖，进行HE染色。HE染色可见FAM55A转基因小鼠心脏心肌细胞不均匀肥大，但不发生排列紊乱(封3图4)。

3 讨论

FAM55A基因为一个假说基因，目前还没有关于该基因功能的报道，更没有和心肌病之间联系的相关报道。本文利用Western Blot检测了FAM55A在野生型小鼠多个组织中的表达，发现肺组织中表达最高，脑和睾丸中表达极少，心脏组织中有少量表达。并发现 FAM55A在 cTnTR141W扩张型心肌病小鼠模型心脏组织中的表达比野生型小鼠高，推测其对心脏发育可能具有重要的作用。

本文中，建立了心脏特异表达的人源 FAM55A转基因小鼠。Western Blot结果显示，FAM55A在44号首建鼠心脏组织中与野生型小鼠相比有较高表达。对转基因小鼠1月龄到5月龄的追踪超声检查，发现FAM55A基因的高表达导致心脏收缩期和舒张期左室前壁持续增厚，3月龄转基因小鼠心脏射血分数和短轴缩短率稍有增强，1月龄和5月龄转基因小鼠心脏功能相对于同龄野生鼠无变化。心脏组织病理观察结果显示，FAM55A转基因小鼠心脏心肌细胞虽有肥大但不发生紊乱。总之，FAM55A转基因小鼠心脏左心室发生肥厚，心功能有所增强，推测FAM55A基因的过表达可能和代偿性肥厚有关。

目前，FAM55A基因是一个新基因，本文成功建立了心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠，此转基因小鼠的建立为进一步研究 FAM55A对心脏正常发育的影响，以及FAM55A在心肌病的发生过程中的生物学功能及可能的机制提供了工具动物。FAM55A转基因小鼠与转基因扩张型心肌病和肥厚型心肌病小鼠杂交或者对转基因小鼠实施手术的方法，可进一步研究FAM55A在心肌病发病中的作用，为心肌病的机制研究和治疗提供线索。

［1］Richardson P，McKenna W，Bristow M，et al.Report of the 1995 World Health Organization/International Society and Federation of Cardiology Task Force on the Definition and Classification of cardiomyopathies［J］.Circulation，1996，93：841-842.

［2］冯娟，董伟，全雄志，等。cTnTR141W转基因小鼠扩张型心肌病模型的建立［J］。中国比较医学杂志，2007，17(10)：563-567.

［3］Gordan JW，Ruddle FH.Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei［J］.Science，1981，214(4526)：1244-1246.

［4］Truett GE，Heeger P，Mynatt RL，et al.Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT)［J］.Biotechniques，2000，29(1)：52-54.

［5］Zhou YQ，Foster FS，Nieman BJ，et al.Comprehensive transthoracic cardiac imaging in mice using ultrasound biomicroscopy with an atomical confirmation by magnetic resonance imaging［J］.Physiol Genomics，2004，18：232-244.