天麻素后处理对糖氧剥夺大鼠皮层神经元EphA 4表达的影响

方 莉 付振强 张博爱(通讯作者)

1)郑州大学医院检验科 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

天麻素后处理对糖氧剥夺大鼠皮层神经元EphA 4表达的影响

方 莉1)付振强2)张博爱2)(通讯作者)

1)郑州大学医院检验科 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

目的研究天麻素对糖氧剥夺(oxygen-g lucose dep rivation,OGD)大鼠皮层神经元损伤的保护性作用及EphA4表达的影响。方法提取新生大鼠大脑皮层神经元体外培养7 d,对4组神经元分别施以60m in的OGD,换回正常培养液培养30m in后分别及给予含终浓度为50、125、250、500μmol/L天麻素的培养液作为后处理措施,培养4 h后换回正常条件培养24 h;采用倒置相差显微镜观察神经元形态学变化,LDH活性测定检测神经元损伤情况,CY3荧光染色检测EphA 4表达变化。结果天麻素后处理能降低糖氧剥夺神经元的损伤,降低EphA4表达。结论天麻素对糖氧剥夺神经元损伤有保护作用,该作用与EphA4表达降低有关。

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天麻素;神经元;糖氧剥夺;EphA4

天麻素(Gastrodin)是中药天麻的主要有效成分,具有促进受损脑组织的恢复、镇静、安神、缓解神经性头痛等作用[1]。研究显示天麻素在神经损伤时对多个环节有保护性作用,比如稳定细胞膜、抗氧化、抗凋亡和抗兴奋毒性[2],临床上已用于治疗脑功能损伤、失眠、神经衰弱及神经性头痛等。人肝细胞癌细胞系A4(ery thropoietin p roducing human hepatocellu lar carcinoma cell line A 4,EphA4)在中枢神经系统损伤后由促红细胞生成素生成,在受损侧脑海马神经元和脊髓轴突表达上调,具有许多重要的保护作用如参与轴突生长、突触重塑、调控神经元存活等[3]。本实验用 OGD制作神经元缺血缺氧模型,观察天麻素后处理对其影响,并探讨E-phA4在该过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物及主要试剂 健康新生SD大鼠(SPF级)60只,雌雄不限,购自郑州大学医学院实验动物中心。Neurobasal培养基、B27和胎牛血清(购自 Gibco公司),胰蛋白酶、多聚赖氨酸、天麻素、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(M TT)(购自Sigma公司),乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)定量检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所),抗鼠EphA4多克隆抗体(购自Santa Cruz公司),CY3荧光试剂盒(购自武汉博士德生物制品公司),其余试剂均为进口分装。

1.2 原代培养新生大鼠皮层神经元 用75%酒精消毒新生SD大鼠(出生24 h以内),严格无菌条件下断头,将双侧大脑皮层取出置于培养皿内,PBS反复漂洗,解剖显微镜下剥离血管及脑膜。转移脑组织至装有0.25%胰蛋白酶的培养皿,用眼科剪剪成约1 mm×1mm×1 mm的小块,37℃水浴消化30 m in,每隔5 m in晃动一次以加快消化速度。然后加入等体积的含有胎牛血清的培养基终止消化,移入无菌离心管用吸管吹打均匀,1000 rpm/m in离心10 m in,弃上清,加入培养基(Neurobal培养基500m L+B27 10m L+L-谷氨酰胺1 mmol,pH值7.20)吹打使细胞重悬,200目筛网过滤,细胞计数并调整密度为(1～3)×106/cm3,接种到预先用0.01%多聚左旋赖氨酸包被的24孔培养板。置于5%CO2培养箱中,37℃培养24 h后第一次换液,以后每三天换一次液,培养7 d制作氧糖剥夺模型。

1.3 氧糖剥夺模型OGD制备[4]及分组 OGD模型制备方法：神经细胞培养到7d,更换培养基为无糖Earle's平衡盐溶液 (mmol/L,pH 7.2-7.4：NaCl 116,KCl 5.4,MgSO40.8,NaH2PO41.0,CaCl21.8,NaHCO326),将细胞培养板移入潮湿密闭容器,37℃恒温30 min,连续充以5%CO2+95%N2(体积比)的混合气体。Earle's液预先通上述混合气体平衡30 m in。细胞分组：原代神经元培养7d后随机分5组,每组设5个复孔,各组均施以60 m in的OGD后各组分别给予天麻素浓度为0 mg/L,12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100mg/L的培养基,其中第1组为对照组。4h后换回正常培养基培养24 h测定相应指标。

1.4 LDH活性测定 取处理后继续培养24h的培养基上清置于1.5 m L EP管中,每管0.3 m L,3000 rpm/m in离心10 min,按试剂盒说明书测定LDH。

1.5 细胞荧光化学法检测EphA4蛋白表达 各组神经元换回原培养液培养24 h后用4%多聚甲醛固定30 min,含5%牛血清白蛋白的TBST(g/L,Tris碱2.42,NaCl8,Triton X-100 1,pH 7.6)封闭60 m in;1∶100兔抗鼠EphA4抗体,4℃过夜;1∶200 CY3标记的抗兔 IgG作用 60 m in;抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察,免疫阳性细胞呈现红色荧光。以Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析各实验组的荧光图片单个细胞的累积光密度值(integrated op tical density,IOD)和平均累积光密度值,进行统计学分析。

1.6 统计学处理 数据处理分析用SPSS 15.0统计软件。所有数据以均数±标准差表示,每个时间点的各组数值经方差齐性检验后,采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。P＜0.05为差异有统计学意义,P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察 倒置相差显微镜下观察,培养7d的神经元形态成光滑的椭圆形或锥形,大小均匀一致,胞体饱满,突起广泛交叉成网状,折光性强;OGD组神经元折光性下降,胞体出现颗粒,轴突出现串珠,形状僵硬,突起缩短,分支减少。各浓度天麻素神经元形态较OGD组有不同程度的改善,以天麻素浓度为25mg/L组改善最明显。见图1。

2.2 天麻素对OGD神经元LDH活性的影响 与仅施以OGD的神经元比较,各天麻素组神经元均有不同程度的降低,差异有统计学意义,以天麻素浓度为25 mg/L组差异最为显著(P＜0.01)。见图2。

2.3 天麻素对OGD神经元EphA 4蛋白表达的影响 倒置荧光显微镜观察,EphA4免疫阳性神经元胞体、突起均呈红色荧光,但荧光强度不同。与仅施以OGD的神经元平均IOD值比较,各天麻素组神经元有不同程度的降低,差异有统计学意义,以天麻素浓度为25 mg/L组差异最为显著(P＜0.01)。见图3。

3 讨论

我国缺血性脑卒中发病率为120/10万～180/10万,死亡率为60/10万～120/10万,病后存活患者中,残废率高达75%,其神经细胞死亡导致的神经功能缺损对患者的生活质量造成严重影响。

天麻素为兰科天麻属植物天麻Gastrodia elata Blume块茎的提取物,是其有效成分之一,其化学结构为4-羟甲基苯β-D-吡喃葡萄糖甙。进入体内后先被分解成天麻甙元(对羟基苯甲醇),通过血脑屏障,发挥效应[1,5]。天麻素通过对抗

图1 各组神经元光镜照片(×200)

图2 不同浓度天麻素对OGD后神经元LDH释放的影响

图3 不同浓度天麻素对OGD后神经元EphA4表达的影响

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(收稿2011-01-12)