大鼠急性脑出血后神经功能保护的实验研究

张隽 杨子超 孙威王昆祥

大鼠急性脑出血后神经功能保护的实验研究

张隽 杨子超 孙威王昆祥

原花青素(PC)是多酚类化合物，属于生物类黄酮，是迄今为止最强有效的自由基清除剂之一。许多研究已经证明PC能通过多种途径对神经细胞起到保护作用。本项目通过建立大鼠脑出血模型后给予PC治疗，从而评价出血后PC的神经保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 健康W istar大鼠，共40只，质量(250 ±30)g。按随机分组原则分成假手术A组(10只)、脑出血B组(10只)、PC低剂量(50 mg/kg)治疗C组(10只)及PC高剂量(200 mg/kg)治疗D组(10只)。PC于术前给予灌胃，1次/d，连续1周，于术前1 h再灌胃1次。假手术组和脑出血组给予等量的生理盐水灌胃。

1.2 动物模型的建立 大鼠用10%水合氯醛(300 mg/100 g)腹腔注射，暴露前囟，于前囟后0.2 mm，中线右3 mm处钻孔，微量加样器沿针孔垂直进针6 mm缓慢注入动物自体尾动脉血50ul。对照组只进针不注射。术后观察神经症状和体征，24 h后取脑。

1.3 免疫组化染色 按照SABC试剂盒说明书进行。鼠抗Bcl-2、Bax和caspase-3多克隆抗体(Sigma公司)，工作浓度分别为1∶100、1∶100和1∶200。在400倍镜下随机取血肿周围4个不重叠视野，计数caspase-3、bcl-2和bax阳性细胞数(棕黄色颗粒为阳性细胞)。

1.4 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件数据处理，结果以均数±标准差(±s)表示，组间差异显著性检验采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

脑出血灶周围脑组织Caspase-3蛋白的表达。A组脑组织中见少量caspase-3蛋白表达。而B、C、D3组出血灶周围脑组织中可见caspase-3阳性细胞表达水平增高。A组脑组织中未见Bax蛋白、见少量Bcl-2表达。而B、C、D3组出血灶周围脑组织中可见Bax、Bcl-2阳性细胞表达水平明显增高，其中B组表达水平最高，D组表达水平最低。

注:*与A组比较，P＜0.05;B、C、D 3组间比较，各指标均P＜0.05

3 讨论

原花青素(proanthocyanidin，PC)是从葡萄籽中提取出来的多酚类化合物，具有极强的抗氧化及清除自由基能力。Bagchi［1］等发现PC是迄今为止发现的最强有效的自由基清除剂之一，其清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍。PC能下调促凋亡基因c-Jun及P53表达有关，而且在体内外试验中均发现OPC能够改善血脑屏障的通透性［2］。

Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，主要通过阻止细胞凋亡的早期环节而发挥作用［3］。Bax是bcl-2基因家族中重要的凋亡促进基因，可通过其自身形成的Bax同源二聚体发挥促进细胞凋亡作用［4］。脑出血灶周围脑组织Bax蛋白表达增加，表明Bax参于了出血灶周围脑组织中细胞凋亡的调控，应用花青素后Bax蛋白表达明显减少，同时花青素可以增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达，且与剂量相关。caspase-3是caspase级联反应中最关键的效应酶，在凋亡执行过程中起重要作用［5］。花青素对脑出血的保护机制可能通过某种途径抑制caspase-3蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，挽救出血周围脑组织来实现的。

脑出血灶周围脑组织病理改变十分复杂，花青素对脑出血周围的脑组织有保护作用，可能与调控凋亡相关基因的表达，减少细胞凋亡的发生有关，为脑出血的治疗开辟新的道路。

［1］ BagchiD，et al.Protection effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidant against TPA Induced hepatic and brain liquid peroxidation and DNA fragmentation and peritoneal macrophage activation in mice.Gen Pharamc，1998，30(5):771．

［2］ Robert AM，Tixier JM，Robert L，Legeais JM，Renard G.Effect of procyanidolic oligomers on the permeability of the blood-brain barrier.Pathol Biol(Paris)，2001;49(4):298-304．

［3］ Oltvai ZN，Milliaman CL，Korsmcyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivowith aconserved homology， bax， thataccelerates cell death.Cell，1993，74:609．

［4］ Miyashita T，Reed JC.Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line.Blood，1993，81 (1):151．

［5］ 王宇卉，邵福源.Caspase-3与卡配因在神经细胞死亡中的作用.国外医学脑血管疾病分册，2002，10:301-304．

黑龙江省卫生厅课题(项目编号:2006-218);黑龙江省教育厅课题(项目编号:11541152)

150001哈尔滨医科大学附属第四医院(张隽 杨子超);哈尔滨医科大学附属第二医院(孙威);佳木斯大学附属第一医院神经内科(王昆祥)

张隽 Email:hljzhangjun@yahoo.com.cn