RP-HPLC-MS分析漆叶中漆酚类化合物

晁 菲,邵 杨 ,魏朔南

(西北大学生命科学学院,陕西西安 710069)

中国古书《后汉书·方技列传》与《三国志》中均载有延年益寿之古方“漆叶青黏散”[1]。其中漆叶为漆树科 (Anacardiaceae)漆属 (Toxicodendron)植物漆树 (Toxicodendron vern icifera Stokes)的叶。《本草纲目》在乔木类漆项下记载其益精神、聪耳目,主治五尸劳疾、杀虫[2]。但时至今日,有关漆叶的药用研究与应用却少有报道。仅李映丽[3]对漆叶的生药学进行了研究,并采用薄层层析法确定其含漆酚。有关漆酚的研究:Du[4]首次用 RP-HPLC法对生漆中未衍生化的漆酚进行了分离;D raper[5]、Kim[6]及李林[7]等通过液质联用技术分析指出,生漆中含有 C15和 C17的饱和、单烯、二烯及三烯等不同漆酚类化合物。本实验应用 HPLC分析技术建立了漆叶中漆酚类成分的分离方法,并结合液 -质联用技术,利用其在中药材成分定性方面的优点对漆叶中的成分进行了定性分析,为漆叶的临床应用提供参考。

1 仪器、试剂与材料

Agilent 1100系列高效液相色谱 -电喷雾 -离子阱质谱联用仪:包括 ESI离子源、SL型离子阱质谱和 Chemistation 5.2工作站等;Waters 2965型高效液相色谱系统:包括 2695型高压恒流泵、2996 PDA检测器和 Empower系统等;Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;SENCOR系列旋转蒸发仪;SHB-Ⅲ循环水多用真空泵;KH-200KDE型高功率数控超声波清洗器;TB-114型电子分析天平;Millipore超纯水仪。

实验材料漆叶于 2009年 7月采自陕西平利县。甲醇、乙腈为色谱纯 (天津化学试剂厂),水为Millipore超纯水,其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液制备

漆叶 10 g无水乙醇 30 m L浸泡 3次,合并滤液回收乙醇,所得物用氯仿 -水 (2∶1)萃取 3次,弃去水相,收集氯仿层并挥去溶剂即得浸膏。精密称取该浸膏 0.01 g,甲醇溶解过滤,定容至 50 mL,过0.22μm滤膜,备用。

2.2 HPLC分析

2.2.1 流动相及比例的确立

通过对甲醇 -水和乙腈 -水两种体系进行考察发现,使用甲醇 -水洗脱时,分离效果不理想;而使用乙腈 -水洗脱时灵敏度较高,且主要色谱峰达到较好分离。进一步对乙腈 -水的不同比例 85∶15、88∶12、91∶9、94∶6进行优化选择 ,结果发现 ,当流动相的比例为 91∶9时,各色谱峰分离度好、峰形窄、基线平稳。

2.2.2 检测波长的确定

本实验采用二极管阵列检测器 (PDA)对供试品进行了全波段扫描,扫描波长为 190～600 nm。结果表明,在 380 nm处检测到的峰数目较多,且多数色谱峰的响应值较大,故以 380 nm作为漆树叶子提取物的 HPLC分析波长。

2.2.3 流速及柱温的选择

通过对 0.3、0.6、0.8 mL·min-1等不同流速及25、30、35℃等不同柱温进行比较发现:流速 0.6 mL·min-1、柱温 35℃的色谱条件分离效果最佳。

2.2.4 色谱条件的确立

经上述参数优化后,确立色谱条件:流动相为乙腈 -水 (91∶9 v/v);流速 0.6 mL·min-1;检测波长380 nm;柱温 35℃;进样量 20μL。漆树叶子提取物的 HPLC分析见图1。

图1 样品 HPLC分析谱图

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 精密度试验

取同一份供试品溶液,按 2.2.4节方法重复进样 5次,测得 10个主要色谱峰峰面积积分值的 RSD均小于 3%,表明本法精密度良好。

2.2.5.2 重复性试验

取同一漆树叶样品 6份,按照 2.2.1节方法制成供试品溶液、2.2.4节方法进行测定,结果 10个主要色谱峰峰面积的 RSD均小于 2%。

2.2.5.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液 ,于 0、4、8、16、24、48 h分别进样,测定峰面积,计算 10个主要色谱峰的 RSD均小于 3%,表明供试品溶液在 48 h内较稳定。

2.3 HPLC-M S分析

2.3.1 分析条件

色谱条件同 2.2.4节,之后 2∶1分流,1/3流出液进入质谱分析。其条件为:电喷雾离子化源负离子模式扫描;雾化气为高纯氮气、压力为 35.0 p si;干燥气温度为 350℃、流量为 8.0 L·m in-1;扫描质量范围为 100～1000 m/z。

2.3.2 测定结果

经 SL多级离子阱质谱测定,漆酚类化合物在一级质谱中大多以准离子分子形式存在,很少有碎片离子,并且二级质谱中碎片信息也较少,主要峰的质谱图见图2。通过分析各液相色谱峰与总离子流图中所对应离子峰的质谱信息,并结合已有相关文献报道,可对液相所得各峰进行归属 (见表1),定性鉴别出 9个漆酚类化合物,另 1个为未知物。

图2 4个主要色谱峰的质谱图

表1 样品质谱分析结果

3 讨 论

关于生漆和漆树树皮中漆酚的 HPLC分析研究已有较多报道[4-8]。本文结合国内外研究结果,在对流动相体系、波长、流速及柱温等条件进行优化选择后,建立了漆叶中漆酚类化合物 HPLC分离的最佳条件:乙腈 -水 (91∶9 v/v)为流动相、流速 0.6 mL·m in-1、波长 380 nm、柱温 35℃。该分析方法快速简便、灵敏度高、重现性好,相比文献[3]中所用薄层层析法,其结果更为精确。

液质联用分析显示,化合物 1、2、4、8和 9为 C15类漆酚化合物,其中 1与 8为三烯漆酚;化合物 3、5、6和 7属于 C17类漆酚化合物,其中 3、6和 7分子量相同,均为 C17三烯漆酚;但各个化合物在液相分析中所对应色谱峰的保留时间不同,且总离子流图中信号也有差异;由此推断 1与 8可能为同分异构体,同时 3、6和 7之间也存在同分异构现象,其具体结构还有待确定。对于 m/z为 809.4的化合物 10,该分子量在以往相关文献中未见报道,有待进一步鉴定。此外,漆叶中漆酚类化合物不仅存在单体,而且还有二聚体形式 (如化合物 1、8),这可能与漆酚在空气或有氧环境中易被氧化聚合有关[9]。

中药干漆具有祛瘀、破积、通经、止痛、杀虫等功效[10],它经生漆炮制而成,生漆的主要成分为漆酚。据文献报道[11],生漆漆酚类化合物中主要为三烯漆酚,将漆酚尤其是三烯漆酚的含量检测作为干漆药材质量控制的标准具有重大意义[6]。本研究结果显示,漆叶中三烯漆酚的相对峰面积占总峰面积的70%以上,表明漆叶与生漆中漆酚类化合物的组成与含量相似,即与干漆的入药成分相近。同时,漆叶入药有主治五尸劳疾、杀虫之功效,与干漆也具相似之处。据此推测,漆酚类化合物可能为漆叶具有药效的主要成分之一。

[1] 刘自忠.华佗所传漆叶青黏散考辨[J].浙江中医杂志,1999,(12):531-532.

[2] 李时珍(明).本草纲目:下册 [M].北京:人民卫生出版社,1985,1993.

[3] 李映丽,吕居娴,焦文旭,等.漆叶的生药学研究[J].中国生漆,1991,10(1):1-3.

[4] Du YM,Oshima R,KumanotaniJ.Reversed-phase liquid chromatographic separation and identification of constituentsof uroshiol in the sap of the lac tree,Rhus vernicifera[J].J Chromatogr A,1984,284:463-473.

[5] Draper W M,WijekoonD,Mckinney M,et al.Atmospheric Pressure Ioni-zation LC-MS Deter mination of Urushiol Congeners[J].J Agric Food Chem,2002,50(7):1852-1858.

[6] Kim D H,Choi J O,Yang J S.Analysis of urushiols by liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization-Ion trap mass spectrometry[J].J Liq Chromatogr Related Technol,2003,26(1):17-28.

[7] 李 林,魏朔南.生漆漆酚类化合物的 HPLC-ESI-M Sn分析[J].中草药,2008,39(12):1786-1787.

[8] Yamauchi Y,M urakam i T,Kumanotani J.Separation of urushiol by high-performance liquid chromatography on an 8%octadecylsilane chemically bonded silica gel column with electrochemical detection:Analysis of urushiol in the sap of lac trees(Rhus vernicifera)and that in the japanese lac-making process[J].J Chromatogr A,1981,214(3):343-348.

[9] Oshima R,Yamauchi Y,Watanabe C,et al.Enzym ic Oxidative Coup ling of Urushiol in Sap of the Lac Tree,Rhus vernicifera[J].J O rg Chem,1985,50(15):2613-2621.

[10] 金莲花.中药干漆的药理作用及临床应用[J].现代医药卫生,2007,23(16):2467-2468.

[11] 章文贡,甘景镐.中国生漆成分研究 -1.生漆漆酚提纯的新方法[J].福建师范大学学报,1978(1):1-5.