八角叶总黄酮的提取及其捕获自由基作用研究

莫丽玲,肖词英,黄锁义,黄世稳,黄丽秀,马连荣

(1.右江民族医学院医学检验学院,广西百色 533000;2.右江民族医学院药学系,广西百色 533000)

八角茴香 (Illicium verum Hook.f.),又称大茴香、八角、八月珠,是木兰科八角属植物,是我国南方重要的“药食同源”的经济树种,主要分布在我国的广西、广东、云南等省。其干燥成熟果实含有芳香油约 5%～8%,脂肪油约 22%以及蛋白质、树脂等,为我国的特产香辛料和中药,也是居家必备的调料,在食品加工业及香料工业广泛应用;同时八角具有健胃止咳的功效,医药上用于治疗神经衰弱、消化不良、疥癣等症,八角是抗流感特效药“特敏福”的主要原料[1]、是有效对付致命的 H 5N1禽流感病毒的药物“达菲”的重要成分[2]。我国目前消费的八角作香料和药物使用,研究表明[3-5]:八角茴香的化学成分主要有挥发性化合物、倍半萜内酯及其衍生物、黄酮类成分 (如八角茴香果实中含有 3-芸香糖,3-葡萄糖,3-半乳糖取代的山萘酚和槲皮素,3-鼠李糖槲皮素,3-木糖槲皮素以及游离的山萘酚和槲皮素等)、苯丙烷和木脂素类、糖脂,磷脂 (包括卵磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇),β-谷甾醇,菜油甾醇和维生素 E,胡萝卜苷和莽草酸。红花八角茎、叶中还含三十烷醇 -1,莽草酸和槲皮素 -3-O-鼠李糖苷。八角种子还含油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸等脂肪酸。八角茴香的药理作用有[3,6]:抑菌作用、升高白细胞作用、镇痛作用、其它作用:茴香醚具雌激素样作用和较强的致敏作用。

黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用[7]。目前,对八角的研究多是芳香油、茴香油树脂的提取和应用[3]。近年来,超声技术应用于提取植物中的生物碱、黄酮、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道[8],表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。但超声技术应用于提取八角植物黄酮及其鉴别的研究未见报道,为此,本文应用超声技术提取八角植物叶总黄酮及其对羟自由基清除作用研究,现报道如下。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

材料:新鲜八角叶 (采自广西南宁、贺州、河池、钦州、百色)。

试剂:95%乙醇;亚硝酸钠 AR;硝酸铝 AR;氢氧化钠 AR;三氯化铝 AR;盐酸 AR;氨水 AR;乙酸镁 AR;镁粉 AR;正丁醇 AR;冰醋酸 AR;乙酸乙酯AR;芦丁标准品 (中国药品生物制品检定所)

仪器:KQ5200DB型数控超声波清洗器 (超声工作频率 40KHz,昆山市超声仪器有限公司);UV-755B紫外可见分光光度计 (上海分析仪器总厂);ZF-I型三用紫外分析仪 (上海顾村光电仪器厂);SHB-III循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 测定条件的选择

1.2.1 波长的选择

取新鲜八角叶,烘干,粉碎。称取八角叶的粉末5 g,分别以 60%乙醇、石油醚、蒸馏水为溶剂,分别以温度为 80℃,功率为 100 W,超声波提取 2.0 h,抽滤。滤渣分别再加相应溶剂,超声波提取 2.0 h,抽滤,各分别合并 2次滤液,即黄酮粗提液,取任意产地的黄酮粗提液适量,在 0.30 m L 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下,经硝酸铝显色后,以试剂为空白液在 420～700 nm波长范围测定络合物的吸光度,络合物于 510 nm波长处有最大吸收,故测定时选用此波长。

1.2.2 标准曲线的制备

精密吸取芦丁对照品标准溶液 (每 1 mL含有无水芦丁 0.2 m g)0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 mL分置再加 10%硝酸铝溶液 2.0 mL,混匀,放置6 m in,加 5%氢氧化钠溶液 20 m L,最后用 60%乙醇于 50 mL容量瓶中,各加 60%乙醇 12mL,加 5%亚硝酸钠溶液 2.0 mL,混匀,放置 6 m in,稀释至刻度,摇匀,以第 1瓶为空白溶液,用 UV-755B紫外可见分光光度计,在 510 nm波长处测定吸光度,建立回归方程,结果见表1。

表1 紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度

根据上表得回归方程:A=4.054 1×10-4+

1.413 6C,r=0.999 0。

1.2.3 超声波与非超声波提取的对比实验

取新鲜八角叶,烘干,粉碎。称取八角叶的粉末5 g,分别以 60%乙醇、石油醚、蒸馏水为溶剂,分别以温度为 80℃,功率为 100 W,超声波提取 2.0 h,抽滤。滤渣分别再加相应溶剂,超声波提取 2.0 h,抽滤,各分别合并 2次滤液,即黄酮粗提液,分别取提取液稀释 10倍,按 1.2.2节方法测其吸光度 (非超声波法:在 1.2.3节方法中,把超声波提取 2.0 h改为在 80℃下分别以 60%乙醇、石油醚、蒸馏水为溶剂回流提取 2.0 h,其余方法一样)。结果见表2。

表2 超声波与非超声波提取液的吸光度

由表2对比可知,采用以 60%乙醇为溶剂的超声波法提取黄酮的吸光度最大,提取效率最高。故超声波法提取总黄酮宜用乙醇为提取溶剂。

1.2.4 不同温度对超声波提取总黄酮的影响

取新鲜八角叶,烘干,粉碎。称取八角叶的粉末5 g,以 60%乙醇为溶剂,功率为 100 W,以不同温度超声波提取 2.0 h,抽滤。滤渣加 60%乙醇,超声波提取 2.0 h,抽滤,合并 2次滤液,即黄酮粗提液。取提取液稀释 10倍,按 1.2.2节方法测其吸光度,结果见表3。

表3 不同温度超声波提取液的吸光度

由表2可知,温度为 80℃提取黄酮的吸光度较大,提取效率较高,故超声波法提取总黄酮宜在 80℃进行。

1.2.5 不同浓度乙醇对超声波提取总黄酮的影响

取新鲜八角叶,烘干,粉碎。称取八角叶的粉末5 g,以不同浓度乙醇为溶剂,功率为 100 W,以温度80℃超声波提取 2.0 h,抽滤。滤渣加相应乙醇,超声波提取 2.0 h,抽滤,合并 2次滤液,即黄酮粗提液。取提取液稀释 10倍,按 1.2.2节方法测其吸光度,结果见表4。

表4 不同浓度乙醇超声波提取液吸光度

由表4可知,乙醇浓度为 90%提取黄酮的吸光度较大,提取效率较高,故超声波法提取总黄酮宜用90%乙醇为提取溶剂。

1.2.6 不同功率对超声波提取总黄酮的影响

取新鲜八角叶,烘干,粉碎。称取八角叶的粉末5 g,以不同浓度乙醇为溶剂,温度为 80℃,不同超声功率条件下提取 2.0 h,抽滤。滤渣加相应乙醇,超声波提取,抽滤,合并 2次滤液,即黄酮粗提液。取提取液稀释 10倍,按 1.2.2节方法测其吸光度,结果见表5。

表5 不同超声功率提取液吸光度

由表5可知,超声功率为 60 W时总黄酮吸光度最大,提取效率最高,故超声波法提取总黄酮宜用60 W超声功率。

1.2.7 不同时间对超声波提取总黄酮的影响

取新鲜八角叶,烘干,粉碎。称取八角叶的粉末5 g,以 90%乙醇为溶剂,温度为 80℃,功率为 60 W,在不同时间的条件下提取,抽滤。滤渣加 90%乙醇,超声波提取相应的时间,抽滤,分别合并 2次滤液,即黄酮粗提液。取提取液稀释 10倍,按 1.2.2节方法测其吸光度,结果见表6。

表6 不同时间超声波提取液吸光度

由表6可知,提取黄酮时间为 3.0 h时总黄酮吸光度较大,提取效率较高,故超声波法提取总黄酮的提取时间为 3.0 h。

最后确定提取总黄酮的最佳工艺条件为:溶剂为 90%乙醇,温度为 80℃,超声波功率为 60 W,提取时间为 3.0 h。

2 结果与讨论

2.1 不同产地八角叶总黄酮含量的测定

取不同产地新鲜八角叶,烘干,粉碎。分别称取八角叶的粉末 5 g,以 90%乙醇为溶剂,温度为 80℃,功率为 60 W,提取 3.0 h,抽滤。滤渣加 90%乙醇,超声波提取相应的时间,抽滤,分别合并 2次滤液,即黄酮粗提液。取提取液稀释 10倍,按 1.2.2节方法测其吸光度,结果见表7。

表7 不同产地总黄酮含量

2.2 回收实验

精密量取样品提取液 2.0 mL,加入 2.0 mL芦丁对照品,同 2.1节方法测定吸光度,求出回收率为97.25%。

2.3 鉴别实验

2.3.1 颜色反应[9]

取八角黄酮提取液进行颜色反应,结果为:紫外光下呈色反应有灰褐色并有荧光斑点;浓氨水反应紫外光下有极明显的黄褐色荧光斑点;三氯化铝反应紫外光下有黄色荧光斑点;乙酸镁反应紫外光下有黄色斑点;盐酸 -镁粉反应有紫红色。

2.3.2 纸层析[9]

用正丁醇 ∶醋酸 ∶水 =4∶1∶5(体积比 )为展开剂 ,取样品溶液进行纸层析,在紫外光下呈荧光斑点。

2.4 药理实验[10]

参照 Fenton反应的方法建立反应体系模型[11],通过 H2O2与 Fe2+混合产生·OH,但由于·OH具有很高的反应活性,存活时间短,若在反应体系中加入水杨酸,就能有效地捕捉·OH,并产生有色产物。根据固定反应时间法,在相同体积的反应体系 (8.8 mmo l/L H2O21 m L,9 mmo l/L Fe2+1 m L,9 mmo l/L 1 mL水杨酸 -乙醇溶液)加入一系列不同浓度的总黄酮提取液,在 510 nm处分别测其对·OH的清除作用,结果见表8。

其清除率计算公式:

结果表明,八角叶总黄酮提取液对由 Fenton体系产生的·OH有很好的清除作用,清除率随着黄酮类物质浓度的增大而增大。

表8 不同浓度的总黄酮提取液对·OH的清除率

3 结 论

超声波提取八角叶总黄酮的最佳工艺条件是:

溶剂 90%乙醇,温度 80℃,超声波功率 60 W,提取时间 3.0 h,超声波提取效率远高于传统的乙醇浸提法,河池产八角叶总黄酮含量最高,其次是钦州和百色,提取物总黄酮对羟自由基有很好的清除作用,为八角的药效学、药代动力学、分子药理学和制剂学等方面进行进一步的研究工作提供了参考依据。

(注:本文荣获 2009年广西高校化学化工类论文及设计竞赛三等奖)

[1] 法新社.中草药风行全球,大钱被日韩赚了 [N].参考消息,2005-10-29(8).

[2] 法新社.八角茴香:对付禽流感的利器[N].参考消息,2005-11-02(7).

[3] 王 琴,蒋林,温其标,等.八角茴香的研究进展 [J].中国调味品,2005(5):18-22.

[4] Kouno I,Yang C S, Iwamoto C,et al.Anewtriphenyl--type neolignan and a biphenylneolignan from the barks of Illiciuum simon sii[J].Chem Pharm Bull,1994,42(1):112.

[5] KounoI,Yang C S,Hashimoto M,et al.Isolation of neoanisatin rivatives from the pericarps of Illiciummajus with other constituents[J].Chem Pharm Bull,1991,39(7):1773.

[6] KounoI,Yang C S,Morisaki T,et al.Two new Sesquineolignans from the bark of Illicium dunnianum[J].Chem Pharm Bull,1991,39(10):2606.

[7] 李洪玉,孙静芸,戴诗文.竹叶黄酮提取物的生产工艺条件研究[J].中国现代应用药学,2004,21(5):371-372.

[8] 黄锁义,黎海妮,唐玉莲,等.超声波提取芒果叶总黄酮[J].中国现代应用药学,2006,23(6):455-456.

[9] 邹勇芳,黄锁义,李卫彬,等.肉桂植物总黄酮的超声波提取工艺研究[J].食品研究与开发,2008,29(4):20-23.

[10] 黄锁义,罗建华,张丽丹,等.茉莉花茎总黄酮提取及对羟自由基清除作用[J].时珍国医国药,2008,19(3):592-593.

[11] 李贵荣,杨胜圆.党参多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用[J].化学世界,2001,42(8):21-22.