酸溶性黑木耳多糖抗氧化性研究

王振宇,张宁,赵鑫*

(1.东北林业大学林学院,哈尔滨 150040;2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,哈尔滨 150086)

黑木耳(Auricularia auricular)营养丰富,食味鲜美,不但是营养价值很高的实用菌,同时也是具有药用价值很高的药用菌。我国黑木耳资源丰富,为开发利用黑木耳提供有利的资源条件。黑木耳子实体具有益气强身、补血养气、润肺止血、通便秘等功效,临床治疗高血压、血管硬化等。药理和植物化学成分分析表明,黑木耳中主要活性成分是多糖类化合物。黑木耳多糖具有抗疲劳增强免疫力等作用[1-2]。近年来食用菌多糖的开发逐渐引起人们的重视,食用菌多糖具有很强的抗氧化能力例如灰树花多糖[3]。但是至今没有研究黑木耳多糖的抗氧化性。本文采用缓冲溶液提取酸溶性黑木耳多糖并用不同浓度乙醇分级,测其抗相氧化能力为黑木耳在食品与生物医药开发方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生黑木耳:产自于大兴安岭,烘干保存。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、ABTS均为Sigma试剂公司;其余均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-98-11A型电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;FA2004电子分析天平,上海天平仪器厂;PHS-3C精密pH计,上海雷磁厂;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析仪器公司;ALPHAL-2真空冷冻干燥机,Germany;R-205B旋转蒸发仪,上海申胜仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 酸溶性黑木耳分级多糖的提取

将黑木耳粉末以一定的磷酸盐缓冲溶液(pH=6)比浸泡。水浴 85℃下浸提 4h,以 4500r/min离心10min。滤渣分别进行第二次浸提,离心并与滤液合并,上清液减压浓缩至原体积的1/3。在磷酸盐溶液浸提的浓缩液中,分别加乙醇调醇浓度为50%进行醇沉淀(APG6-1),收集沉淀;乙醇调醇浓度为75%进行醇沉淀(APG6-2),收集沉淀;乙醇调醇浓度为100%进行醇沉淀(APG6-3),收集沉淀。沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤。将黑木耳多糖savage[4]法脱蛋白,重复4次,醇沉,离心,沉淀依次用无水乙醇丙酮、乙醚洗涤。自来水透析48h,蒸馏水透析24h,浓缩后真空冷冻干燥得到酸溶性黑木耳分级多糖。

1.3.2 ABTS+·清除能力测定

参考WAN[5]方法,并作适当修改。用甲醇配置2.6 mmol/L过硫酸钾,用过硫酸钾溶解ABTS,配成7.4 mmol/L ABTS+·储备液。在室温及避光条件下,静置过夜。配制ABTS+·测定液:吸取1 mL储备液用甲醇稀释54.7倍,在744nm波长吸光度为0.700±0.020(吸光值为0.710)。测定:取2850 μ L ABTS+·测定液,加入150μ L样品待测液,混合液在黑暗的室温下放放置2 h,在744nm波长处测定溶液混合物的吸光度

1.3.3 DPPH·清除能力的测定

参考Shimada[6]和林恋竹[7]的方法,并作适当修改。取2 mL各浓度的样品溶液并加入0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液2 mL,混合均匀并放置在避光条件下保存30 min。在517 nm测得各浓度的样品溶液吸光度

1.3.4 超氧自由基清除能力的测定

参考Biao[8]的方法,并作适当修改。用10 mmol/L的HCl溶液配置 10 mmol/L邻苯三酚,并和50 mmol/L Tris-HCI缓冲液 pH8.2的在25℃的恒温水浴锅中水浴保温10 min。分别加入的 Tris-HCI缓冲溶液2.3 mL,待测样品液0.5 mL。当加入10 mmol/L的邻苯三酚20μ L,迅速混合均匀反应1 min时开始测定于320 nm处测定吸光度,每隔30 s记录吸光值,至反应6 min。

1.3.5 金属鳌合力的测定

参考Dinis[9]的方法,并作适当修改。分别加入待测样品液1 mL,3.7 mL甲醇和2 mmol/L的氯化亚铁0.1mL溶液放置10min。最后加入5 mmol/L ferrozine试剂0.2 mL。冷却至室温10 min,在562 nm处波长下测吸光值。吸光值越低表明螯合能力越强。

2 结果与分析

2.1 酸溶性黑木耳分级多糖对ABTS+·的清除作用

图1 酸溶性黑木耳分级多糖对ABTS+·的清除能力

如图1所示,三种酸溶性黑木耳多糖对ABTS+·自由基都有很显著的清除作用。而且在0.1～10 mg/mL浓度范围内,APG6-1 APG6-2和APG6-3的浓度与清除率呈量效关系,且在浓度为20 mg/mL时清除率达到最高,APG6-1为 84.9%,APG6-2为88.2%,APG6-3为 98.4%,而阳性对照VC、BHA、VE的清除率分别为98.3%、99.4%、97.2%。表明APG6-3的抗氧化活性高于VE,与VC相持平,比BHA略低,且明显好于APG6-1和APG6-2。

2.2 酸溶性黑木耳分级多糖对DPPH的清除作用

如图2所示,3种酸溶性黑木耳多糖对DPPH自由基都具有显著的清除作用,且在0.1～20mg/mL浓度范围内,APG6-1 APG6-2和APG6-3都随着样品浓度的增加,对DPPH自由基清除率也逐渐增加。以阳性对照 VC、BHA、VE,在 20 mg/mL时清除率分别为89.9%、96.9%、99.3%。APG6-3和 APG6-2在 20 mg/mL时对 DPPH自由基清除率达到90.3%和86.7%,虽然不及BHA、VE,但是与VC相持平。而APG6-1清除DPPH自由基为73.5%。

图2 酸溶性黑木耳分级多糖对DPPH的清除作用

2.3 酸溶性黑木耳分级多糖对超氧自由基的清除作用

图3 酸溶性黑木耳分级多糖超氧阴离子的清除作用

超氧阴离子自由基具有很高的毒性,它可以经过一系列反应生成其它氧自由基。如图3所示,阳性对照VC在浓度在2mg/mL时清除率最高,为 95.5%。在浓度为0.1～2 mg/mL时,APG6-3清除率最高,对超氧阴离子清除率由31.8%增到74.9%,与VC相对低些。而APG6-2和APG6-1的清除超氧阴离子能力只有61.3%和57.1%

2.4 酸溶性黑木耳分级多糖对金属离子螯合力

图4 酸溶性黑木耳分级多糖对金属离子螯合力

研究表明,金属离子与体内氧化反应有关,螯合金属离子是有效的清除OH自由基的方法。如图4所示,阳性对照柠檬酸、EDTA,在10mg/mL时螯合力为15.3%、97.3%,柠檬酸不是金属离子螯合的很好的阳性对照剂。在0.1～5mg/mL浓度范围内,APG6-1 APG6-2和APG6-3多糖的浓度与螯合力呈量效关系。5～10mg/mL浓度范围内,三种多糖对金属离子螯合力趋于平缓。明显APG6-3和APG6-2在10mg/mL时对金属离子螯合力已经达到86.3%和82.1%,APG6-1只有78.9%。

3 结论

本研究发现酸溶性黑木耳多糖都表现出很强的抗氧化能力,但是不同提取工艺下的多糖,在不同抗氧化体系中,其抗氧化活性差异显著。其中,APG6-3具有较强的清除DPPH、ABTS、超氧阴离子和金属离子螯合能力。在实验浓度范围内,最大作用效应分别为98.4%、99.3%、74.9%和86.3%。为进一步研究黑木耳多糖其生物活性奠定基础。

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