星点设计-效应面法优化白茅根总酚酸提取工艺

刘荣华，陈石生，任刚，邵峰，黄慧莲，杨明

(江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004)

白茅根为禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.Var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根茎，又名兰根、地筋、白花茅根、茅草根、甜草根等，广泛分布于全国各地，具有凉血止血、清热生津、利尿通淋之功效［1］。白茅根酚酸类成分主要有tricin、jaceidin、quercetagetin-3，5，6，3＇-tetramethyl ether、3，5-Di-O-methyl-kaempferol、3-hydroxy-4-methoxy benzaldehyde、impecyloside、cylindol A B、graminones A B、imperanene、5-hydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone、5-hydroxy-2-styrylchromone、5-hydroxy-2-［2-(2-hydroxyphenyl)ethyl］chromone、flidersiachromone［2-7］。药理研究显示白茅根中酚酸类成分具有血管舒张、血小板聚集抑制活性、抗氧化活性、细胞毒性、p-糖蛋白抑制活性、糖原磷酸化酶A抑制活性、抗炎活性、抗HBV病毒复制、神经保护作用等生物活性［8-10］。因此，有必要对白茅根中酚酸类成分的提取工艺进行研究。

本研究采用超声波辅助提取法(Ultrasound-associated extraction，UAE)，在单因素考察的基础上利用星点设计(central composite design，CCD)，通过三维效应面(three dimensional response surface)进行数据处理与拟合，优化白茅根总酚酸的提取工艺，为白茅根中酚酸类成分的提取提供了依据。

1 材料

KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-2550型紫外分光光度计(日本Shimadzu公司);R-210型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);Sartorious BT 124S型万分之一天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司);S-4药典检验筛(浙江上虞市华康化验仪器厂)。

白茅根于2010年3月采于江西中医学院湾里校区，经江西中医学院赖学文教授鉴定为禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.Var.major(Nees)C.E.Hubb.的根茎，凭证标本存于江西中医学院标本馆。

没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110831-200803)，铁氰化钾、三氯化铁、盐酸、无水乙醇均为分析纯，双蒸水自制。

2 方法与结果

2.1 白茅根总酚酸的测定

2.1.1 材料的处理将采挖的新鲜白茅根洗净处理后置烘箱中60℃恒温干燥，后用粉碎机粉碎，过药典四号筛，－20℃冷冻保存备用。

2.1.2 标准曲线的制备参考文献［11］，并作改进，精密吸取19.70 μg/mL没食子酸标准品溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、2.80 mL于25 mL量瓶中，加入新鲜配制的0.10 mol/L三氯化铁-0.008 0 mol/L铁氰化钾(1∶1)混合液1 mL，摇匀，暗处放置5 min，再用0.10 mol/L盐酸定容至刻度，摇匀，暗处放置20 min，在波长695 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标y，没食子酸质量浓度x(μg/mL)为横坐标，得回归方程为:y=0.291 1x+0.054 9，R2=0.998 5，线性范围为0.039 33～2.200 8 μg/mL。

2.1.3 白茅根总酚酸的测定准确称取白茅根粉末2.0 g于100 mL具塞锥形瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、温度条件下超声波辅助提取一定时间，取出过滤，滤液在40℃下减压干燥，用适量60%乙醇分次溶解，定容至10 mL，取提取液0.3 mL，用60%乙醇定容至10 mL即得供试品溶液，取0.5 mL供试品溶液于10 mL量瓶中，按2.1.2项下方法测定吸光度，计算总酚酸量。每个实验重复做3次，取平均

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇对白茅根总酚酸提取效果的影响准确称取2.0 g白茅根干粉6份，置于100 mL平底烧瓶中，按料液比1∶20，分别加入30%、40%、50%、60%、70%、90%的乙醇，在40℃下超声提取40 min，提取液按2.1.3项下方法处理并测定溶液中总酚酸，结果如图1所示。

从图1可以看出，低浓度乙醇提取时，总酚酸随着乙醇质量浓度的升高而增加，当乙醇为50%时，总酚酸达到最大值，乙醇大于60%后，总酚酸明显降低并处于相对平稳状态。因此，选择50%作为白茅根总酚酸提取的最佳乙醇质量浓度。

图1 乙醇浓度对总酚酸提取效果的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of total phenolics

2.2.2 提取时间对白茅根总酚酸提取效果的影响

按料液比1∶20，加入70%的乙醇，在40℃下分别超声提取20、30、40、50、60、90 min，提取液按2.1.3项下方法处理并测定溶液中总酚酸，结果如图2所示。

从图2可以看出，提取时间为40 min时白茅根总酚酸的质量分数最高，因此，选择40 min作为白茅根总酚酸的最佳提取时间。

图2 提取时间对总酚酸提取效果的影响Fig.2 Effect of extracting time on extraction of total phenolics

2.2.3 提取温度对白茅根总酚酸提取效果的影响

按料液比1∶20，加入70%的乙醇，分别在20、30、40、50、60、70℃下超声提取40 min，提取液按2.1.3项下方法处理并测定溶液中总酚酸，结果如图3所示。

从图3可以看出，在提取温度为20℃时可得到较高的白茅根总酚酸，其后总酚酸随着温度的升高而下降，当温度为50℃时降到最低，而后又有所上升。考虑到酚酸类物质在较高温度下易被破坏，故选择20℃作为最佳提取温度。

图3 提取温度对总酚酸提取效果的影响Fig.3 Effect of extracting temperature on extraction of total phenolics

2.2.4 料液比对白茅根总酚酸提取效果的影响原料按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入70%乙醇，在40℃条件下超声提取40 min，提取液按2.1.3项下方法处理并测定溶液中总酚酸。结果如图4所示。

从图4可以看出，随着料液比的增加，总酚酸显著增加，达到1∶40后再增大料液比时，总酚酸反而降低，过大的溶剂用量会造成浪费，并给一些后续工作如:过滤、浓缩等带来麻烦，因此选择料液比为1∶40。

图4 料液比对总酚酸提取效果的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction of total phenolics

2.3 星点设计试验

2.3.1 因素、水平及指标的确定在单因素试验结果的基础上，料液比固定用1∶40，选取乙醇质量浓度、提取时间、提取温度作为考察对象，采用Design Expert 7.0统计分析软件，以总酚酸为响应值，进行效应面法优化试验，以获取最佳参数。试验因素和水平安排见表1。

2.3.2 表2进行提取，按照2.1.3项下处理方法及2.1.2项下测定方法，测定白茅根总酚酸的质量分数，结果见表2。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

表2 星点试验设计与结果Tab.2 The plan and results for response surface methodology

2.3.3 模型的建立及其显著性检验利用Design Expert 7.0统计软件通过逐步回归表2实验数据进行回归拟合，得到总酚酸对以上3个因素的二次多项回归方程为:

Y=2.646－0.386 81A+0.180 77B+0.359 54C+0.001 739 13AB－0.000 436 625AC－0.000 250 625BC+0.003 239 9A2－0.003 201 09B2－0.005 061 59C2

对该模型进行方差分析，结果见表3。表3显示模型具有高度的显著性(P＜0.01)，失拟项不显著以及R2=0.887 6，可知方程拟合度和可信度均良好，试验误差小，故可用此模型对白茅根总酚酸的提取工艺进行分析和预测。

2.3.4 应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，分析乙醇质量浓度、提取时间和提取温度对白茅根总酚酸的影响。其响应面图见图5～7，3组图直观地反映了各因素对响应值的影响。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of mean square deviation of regress equation

图5 乙醇质量浓度、提取时间及其相互作用对总酚酸影响的响应面图Fig.5 Correlative effects of ethanol concentration and time

图6 乙醇质量浓度、提取温度及其相互作用对总酚酸影响的响应面图Fig.6 Correlative effects of ethanol concentration and temperature

比较3组图并结合表3中p可知:C的一次项、AB、A2、B2、C2对总酚酸影响显著，表明各影响因素对总酚酸得率的影响不是简单的线性关系。

图7 提取时间、提取温度及其相互作用对总酚酸影响的响应面图Fig.7 Correlative effects of extracting time and temperature

为进一步确定最佳提取工艺参数，基于已建立的数学模型，对总酚酸进行最优化设计，得到白茅根中总酚酸的提取条件为:乙醇浓度为40%，提取时间38 min，提取温度为33℃，料液比为1∶40。白茅根总酚酸的预测值为2.71 mg/g。

2.3.5 验证试验为检验实验方法的可靠性，在优化条件下，进行3次平行试验验证，得到白茅根总酚酸的质量分数为2.46 mg/g，与预测值接近，说明此模型可靠。因此，基于星点设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 讨论

超声波辅助提取法(UAE)是采用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，缩短提取时间，提高提取率。该法所需设备简单，操作方便，比一般提取技术更加有效，超声过程中所需提取温度较低，故可以防止目标成分可能的化学降解［12］，而温度过高会加速酚性成分的氧化分解，所以UAE更加适合酚酸类成分的提取。

星点设计(CCD)是在析因设计的基础上，加上星点及中心点而形成的实验次数较少、可采用三维效应面(three dimensional response surface)进行数据处理与拟合的实验设计方法［13］，已在药物提取和处方工艺的优化中有一定的应用［14-16］。本实验在单因素试验的基础上，利用星点设计-效应面法优化白茅根总酚酸的提取工艺，可为白茅根中酚酸类成分的提取提供依据，这对于进一步研究白茅根酚酸类成分具有重要意义。

由单因素试验和星点试验设计及其分析结果获得的超声辅助提取白茅根总酚酸的最佳工艺为乙醇浓度为40%，提取时间38 min，提取温度为33℃，料液比为1∶40。该工艺总酚酸的预测值的质量分数为2.71 mg/g，验证实验总酚酸的质量分数为2.46 mg/g。本研究结果是在实验室小试基础上获得的，还有待在放大实验中进一步验证。

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