拉莫三嗪对戊四唑点燃大鼠模型行为学及抗氧化指标的影响*

梁孝印

(泰山医学院附属泰山医院药学部 271000)

癫痫是由大脑神经细胞过度放电引起的一种发作性脑功能障碍，发病率约7‰[1]。目前，约有80%的病人可通过药物控制病情，仍有约20%的病人病情难以控制。长期癫痫发作常会导致患者氧化应激状态增加。长期应用抗癫痫药物会引起患者认知和行为异常，导致学习和记忆功能的损伤。拉莫三嗪(Lamotrigine, LTG)为苯三嗪类新一代抗癫痫药，可有效控制癫痫发作，还具有一定抗氧化作用[2]。为进一步研究LTG的抗痫作用特点及机制，本实验观察了LTG对戊四唑点燃大鼠模型的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器 DL-CJ-1N高性能无菌实验台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，Morris 迷宫(上海吉量软件有限公司)，SJ210A匀浆机(海门其林医用仪器厂)，PL602-S电子天平(青岛远博仪器设备有限公司)，80-2型离心机(上海医科大学仪器厂)，旋涡混匀器 ( 太仓市科教仪器厂 )，772S可见分光光度计 ( 上海精密科学仪器厂 )，电热恒温水浴锅 ( 天津市泰斯特仪器有限公司 )， BF-2000 M电热恒温箱 ( 北京八方世纪科技技术有限公司 )。

1.1.2试剂 拉莫三嗪(葛兰素史克，批号：ZJ0065，临用前压碎，溶于生理盐水备用)，戊四唑(Johnson Mattheg Company，批号：L16185，)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。其余试剂为国产分析纯。

1.1.3实验动物 wistar大鼠，雌雄各半，共50只，150 ～ 220 g。由山东鲁抗医药股份有限公司动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)20050017。饲养于尺寸为 30 cm ×15 cm ×15 cm 的实验笼内，每笼5只，温度20℃ ～ 24℃，湿度40% ～70%，自由进食饮水。实验均在上午8∶00 ～ 10∶00进行，实验时保持室内安静。

1.2 方法

1.2.1戊四唑(Pentylentrazol, PTZ)大鼠点燃模型制备[3]取40只大鼠，以生理盐水新鲜配制浓度为1.75%的PTZ溶液，腹腔注射PTZ 35 mg·kg-1(亚惊厥剂量)，注射容积为2 ml·kg-1，隔日1次，共给药14次。在注射PTZ后观察1h内动物的行为变化，记录发作潜伏期、发作分级和发作持续时间。发作分级按照Ono′s的6级分级法：0级：无惊厥；1级：点头或头部抽搐； 2级：全身肌阵挛； 3级：头部抽搐加前肢阵挛； 4级：阵挛惊厥加后肢站立；5级：跌倒； 6级：全身强直-阵挛惊厥。凡连续5次出现2级或2级以上记录的大鼠，即为点燃模型大鼠。停药1周，再次用相同剂量的PTZ测试，如仍保持在2级以上惊厥发作的大鼠视为点燃成功大鼠。

1.2.2分组及给药 取正常大鼠10只及造模成功大鼠30只，分为4组，每组10只，即正常对照组、PTZ模型组、LTG组(25 mg·kg-1) 、卡马西平阳性对照组( 60 mg·kg-1)。LTG组每日腹腔注射LTG 25 mg·kg-1，卡马西平阳性对照组每日腹腔注射卡马西平60 mg·kg-1，给药容积为10 ml·kg-1，正常对照组与模型组每日腹腔注射等量生理盐水，每日1次，连续给药32天。

1.2.3PTZ大鼠点燃模型的行为学观察 第28天给药后60 min，除正常对照组之外的各组大鼠均腹腔注射PTZ 35 mg·kg-1，观察1h内大鼠癫痫发作潜伏期、发作持续时间及发作分级。

1.2.4Morris 水迷宫行为学检测(隐藏平台获得实验)

第28天PTZ大鼠点燃模型行为学观察结束后，将大鼠分别放入水中自由游泳120 s，使之熟悉环境，第29日开始Morris 水迷宫行为学检测。Morris 水迷宫池壁上标有东南西北4 个入水点，将水池等分为4 个象限，目标象限的中央放置一圆形隐藏平台，整个实验期间位置保持不变，水温保持 (25 ±1) ℃；实验期间迷宫外足够的参照物，且始终保持不变。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。实验前动物自由游泳2 min ，正式实验每天训练1 次，每次60 s，随机从东、西、南、北各个入水点选择一个，将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。如果动物在60 s 内未找到平台，由实验者将其引至平台，逃避潜伏期记为60 s。实验历时4 d，第1天为训练，后3d 数据作为学习和记忆成绩[4]。

1.2.5对PTZ大鼠点燃模型脑组织氧化应激指标的影响

第32日给药后60 min，除正常对照组之外的各组大鼠均腹腔注射PTZ 35 mg·kg-1，1 h后各组大鼠以10%水合氯醛(400 mg·kg-1, 腹腔注射)麻醉后断头取脑，取大鼠大脑组织块0.5 g，取预冷的生理盐水4.5 ml，400 r·min-1匀浆，制备脑组织匀浆，3000 r·min-1离心15 min，取上清液待测。酶生化法测定大鼠脑组织中蛋白质含量、SOD、 GSH、CAT活性及MDA含量。

1.2.6统计学处理 结果表示为，统计处理采用 SPSS13.0 软件包和 Execl 软件。

2 结 果

2.1 拉莫三嗪对PTZ大鼠点燃模型的抗癫痫作用

PTZ注射过程中，随着给药次数的增加，大鼠逐渐出现凝视、点头、全身肌阵挛、后肢站立，最终发生全身性强直-阵挛性发作伴有跌倒及流涎。PTZ完全点燃的大鼠，有自始至终的发作过程，其惊厥等级分明，全身强直-阵挛性惊厥十分明显。拉莫三嗪等治疗28天后，各治疗组与模型组相比，均可延长癫痫大鼠惊厥发作潜伏期(P< 0.05)、缩短惊厥持续时间(P< 0.01)、降低惊厥发作分级(P< 0.05)。结果见表1 。

表1 拉莫三嗪对PTZ大鼠点燃模型潜伏期、持续时间及发作分级的影响

注：与PTZ模型组比较，1)P< 0.05，2)P< 0.01

2.2 拉莫三嗪对PTZ大鼠点燃模型Morris 水迷宫行为学检测结果的影响

PTZ组的逃避潜伏期较正常组明显延长(P<0.05 )；从29天开始，LTG组与PTZ组比较，其逃避潜伏期缩短(P<0.05)，但同时其逃避潜伏期仍较对照组延长(P< 0.05) ；卡马西平组和LTG组之间的逃避潜伏期差异无统计学意义，LTG组和正常组之间的逃避潜伏期差异无统计学意义。结果见表2 。

表2 拉莫三嗪对PTZ大鼠点燃模型隐藏平台获得实验平均逃避潜伏期的影响

注：1)与正常对照组比较P<0.05，2)与PTZ模型组比较P< 0.05 。

2.3 拉莫三嗪对PTZ大鼠点燃模型脑组织氧化应激指标的影响

大鼠口服给药32天后，脑组织中SOD、GSH、CAT活性及MDA含量，各组与正常组相比：SOD、GSH、CAT活性显著下降，MDA含量显著升高 (P< 0.05 )。LTG组与模型组相比：SOD、GSH、CAT活性显著增高， MDA含量显著降低(P<0.05)。LTG组与卡马西平组相比：GSH活性显著增高，MDA含量显著降低(P<0.05)。结果见表3。

表3 拉莫三嗪对PTZ大鼠点燃模型脑组织氧化应激指标的影响

注：1)与正常对照组比较，P< 0.05；2)与PTZ模型组比较，P< 0.05；3)与卡马西平组比较，P< 0.05。

3 讨 论

PTZ是一种GABAA受体拮抗剂，不破坏脑组织结构，对大鼠的记忆和运动能力无明显影响，常被用于癫痫动物模型的制备[3]。学习、记忆和情感反应是大脑的高级机能，Morris水迷宫实验是一种测试视空间学习能力及记忆能力的常用方法[4]。

癫痫及长期应用抗癫痫药物常可导致认知功能降低，学习能力下降等不良反应，影响患者生活质量[5]。抗癫痫药物引起认知功能损害的机制被认为是由于其增强了γ-氨基丁酸(GABA)对神经传导的抑制作用[6]。LTG为苯三嗪类的新一代抗癫痫药，能稳定神经元膜，阻断对电压敏感的钠通道。其不良反应小，安全性高，与血浆蛋白结合率低，不诱导肝微粒体代谢酶。本研究表明，LTG可有效缩短PTZ点燃大鼠隐藏平台获得实验中的平均逃避潜伏期，证明LTG能提高认知功能，与国外学者的研究结果一致[7]。

认知功能降低同时，难控制的的重症癫痫患者往往存在氧化应激状态加剧，这也是严重影响癫痫患者生活质量的因素之一[8]。本研究表明，PTZ点燃模型大鼠脑组织中SOD、GSH、CAT活性显著降低，MDA含量明显升高。而LTG能显著降低PTZ大鼠点燃模型脑组织中SOD、GSH、CAT活性，降低MDA含量，表明抗氧化可能也是LTG抗癫痫机制之一。

[1] 贾冬, 齐越, 湛鸿利, 等. 癫痫清片对戊四唑大鼠点燃模型的影响[J].中华中 医药学刊, 2009,27(2):308 -310.

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