HPLC法测定清开灵颗粒中黄芩苷的含量*

刘国荣 房绍英 李炳龙 李 珂 周延萌 辛晓明

(1.苍山县人民医院药剂科，山东，临沂 277700; 2.泰山医学院药学院，山东，泰安 271016)

清开灵颗粒由胆酸、猪去氧胆酸、黄芩提取物、栀子、水牛角、金银花、板蓝根和珍珠母等中药组成，具有清热解毒、镇静安神功效。用于外感风热所致发热、烦躁不安、咽喉肿痛及上呼吸道感染等[1]。

黄芩苷(baicalin, C21H18O11)是清开灵颗粒的主要有效成分之一，可作为该制剂的质量控制指标。有文献报道用HPLC外标法测定清开灵颗粒中主要成分的含量[2]。为提高制剂质量控制方法的稳定性和可靠性，本实验建立了以内标法测定清开灵颗粒中黄芩苷含量的高效液相色谱法，用于清开灵颗粒中黄芩苷含量测定效果满意。

1 实验材料

1.1 仪器

LC-10AT高效液相色谱仪(岛津仪器苏州有限公司)；SPD紫外可见检测器(岛津仪器苏州有限公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；R-20G2电子分析天平；DP-01真空压力泵；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料和试剂

黄芩苷标准品(山东省诸城市浩天药业，批号：H20073931)；丹皮酚标准品(中国药品生物制品检定所，批号：110708-200505)；清开灵颗粒(黑龙江省远达药业集团哈尔滨一洲制药有限公司，批号：国药准字Z10930010)；甲醇(色谱纯)；重蒸馏水；磷酸。

1.3 药品配制

1.3.1内标物丹皮酚储备液的配制

精密称取丹皮酚标准品0.0049 g，置于100 ml容量瓶中，用流动相溶解并定容，得内标物丹皮酚的储备液(49 ug/ml)。

1.3.2黄芩苷标准品储备液的配制

精密称取黄芩苷标准品0.0030 g，置于25 ml容量瓶中，用流动相溶解并定容度，得黄芩苷标准品储备液(120 ug/ml)。

1.3.3黄芩苷标准溶液的配制

精密量取黄芩苷标准储备液(120 ug/ml)0.25、 0.5、1.0、2.0和4.0 ml，分别置于25 ml容量瓶中，各加入内标丹皮酚储备液1.0 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为1.2、2.4、4.8、 9.6和19.2 ug/ml黄芩苷标准溶液。

1.3.4样品溶液的配制

取清开灵颗粒适量，研细，精密称取1.5 g，置100 ml容量瓶中，加流动相溶解，超声处理30 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1.0 ml置于10 ml容量瓶中，加入0.4 ml内标丹皮酚储备液，稀释至刻度，摇匀，得样品溶液。

2 方法与结果

2.1 流动相的选择

在流动相甲醇与0.2%磷酸(V∶V)组成分别为40∶60、48∶52、55∶45的条件下，分别取黄芩苷标准溶液20 ul进样，记录色谱图。

结果当甲醇与0.2%磷酸组成为40∶60时，黄芩苷保留时间为18.89 min，耗时较长；甲醇与0.2%磷酸组成为48∶52时，黄芩苷与内标丹皮酚不能有效分离；甲醇与0.2%磷酸组成为55∶45时，黄芩苷和内标丹皮酚的保留时间分别为5.5 min和9.4 min，分离良好，故选择甲醇与0.2%磷酸组成为55∶45作流动相。

2.2 色谱条件

色谱柱为Lichrospher C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.2%磷酸(55∶45)为流动相，流速1.0 ml/min；检测波长为278 nm；柱温为室温。

2.3 方法学考察

2.3.1系统适用性

取浓度为4.8 μg/ml黄芩苷标准溶液20 μl进样，记录色谱图(图1)。结果黄芩苷和内标物丹皮酚的保留时间(tR)分别为5.4 min和9.3 min，二者的分离度R=2.26(R>1.5)。，以黄芩苷色谱峰计算，理论塔板数(N)为3995求。

图1 黄芩苷与内标物丹皮酚的色谱图

2.3.2定量限和检测限

按照黄芩苷标准溶液制备方法，依次制备更低浓度的黄芩苷标准溶液，取20 ul进样。当浓度为1×10-2ug/ml时，S/N=10；当浓度为4.5×10-3ug/ml时，S/N=3。

2.3.3线性关系

分别取系列浓度的黄芩苷标准溶液20 μl进样，各浓度重复进样3次，记录色谱图。以黄芩苷色谱峰面积(Ai)与内标物丹皮酚色谱峰面积(A)的比值(Y)为纵坐标，黄芩苷浓度(C)为横坐标作图，得黄芩苷标准曲线(图2)。黄芩苷在1.2～19.2 ug/ml范围内，与色谱图峰面积比呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.1453C-0.1425，相关系数r=0.9975。

图2 黄芩苷的标准曲线

2.3.4精密度

分别取高、中、低三个浓度的黄芩苷标准溶液20 ul进样，各重复进样5次，记录色谱图，计算黄芩苷与内标物丹皮酚的色谱图峰面积比值。结果三种不同浓度色谱图峰面积比值的RSD分别为1.23%，0.33%，1.00%。

2.3.5重复性

精密称取清开灵颗粒5份，按照样品溶液的制备方法处理，取20 ul进样，每份样品重复进样三次，记录色谱图。结果5份样品峰面积比的RSD值为0.62%。

2.3.6稳定性

按照样品溶液的制备方法新鲜制备清开灵样品溶液，分别在放置0、2、4、6、8、10h时进样20 ul，测定黄芩苷与内标物丹皮酚的峰面积比。结果样品放置10 h，其黄芩苷含量基本稳定，RSD值为0.96%。结果见表1。

表1 黄芩苷稳定性试验结果

2.3.7加样回收率

取已知黄芩苷含量的样品溶液3份，分别精密加入高、中、低3个浓度的黄芩苷标准品适量，测定含量并计算回收率。结果见表2。

表2 黄芩苷在清开灵颗粒中的加样回收率

2.4 样品含量测定

取清开灵颗粒，按照样品溶液的制备方法，平行制备3份样品，取20 ul进样，记录色谱图，由标准曲线计算黄芩苷含量，结果见表3。

表3 清开灵颗粒中的黄芩苷含量

3 讨 论

黄芩苷是中药黄芩和清开灵颗粒中的主要有效成分之一，为黄酮类化合物。测定黄芩苷的含量，是控制黄芩药材质量及其多种制剂质量的重要技术手段，已被广泛用作相关制剂质量控制的主要指标[4-6]。

本文以丹皮酚为内标物，建立了内标法测定清开灵颗粒中黄芩苷含量的高效液相色谱法。该法具有操作简便快速、专一性强、灵敏度高、结果准确稳定等特点。可以用于评价黄芩药材质量和各种含有黄芩苷的制剂及其复方制剂的质量控制。

[1] 卫生部药品标准新药转正标准第十一册[S].1996:21.

[2] 韩杰.HPLC测定清开灵颗粒中黄芩苷、栀子苷及胆酸、猪去氧胆酸的含量[J].中成药，2010,32(2):227-231.

[3] 文敏,李雪,付守廷.黄芩苷药理作用研究新进展[J].沈阳药科大学学报,2008,25(2):158.

[4] 王洪杰，冯宇飞，刘佩莉.HPLC法测定生物样品中双黄连有效成分黄芩苷的含量[J].黑龙江中医药,2008,3(1):52-53.

[5] 刘平，王艳君.HPLC法测定开光复明片中黄芩苷的含量[J].中国药房,2007,18(27):2130-2131.

[6] 李运景,陈钧茂,张锦兴，等.HPLC测定清肺合剂中黄芩苷的含量[J].药品评价,2007,4(4):313-314.