中间层在成釉细胞分化及分泌期的形态学观察*

肖长杰 张 丽 闫利勇 李俊福 陈岱韻 李 纾

(1．泰山医学院附属泰山医院口腔科，山东 泰安 271000；2．泰山医学院附属医院口腔科，山东 泰安 271000；3．山东大学口腔医学院，山东 济南，250012)

成釉器是来源于口腔外胚层衍化的上皮性组织，在釉质形成的过程中起到重要的作用。中间层是牙胚成釉器发育到钟状期而分化出的一种精细上皮性结构，紧邻内釉上皮，在釉质形成过程中这种精细的上皮性结构经历了显著的增生和退化过程后逐渐消失, 存在时间短暂。早在五十年代国外即有学者开始关注中间层细胞在牙齿发育中的作用[1]。本实验选用BALB/c鼠磨牙胚早期发育建立中间层发育的模型，经HE染色,电镜超微结构进行形态学观察, 对釉质正常形态的建立提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

不同发育期SPF 级BALB/C 小鼠(山东大学动物中心提供) ;L EICA RM2135 切片机(德国);OLYMPUS CX71 显微镜及数码成像系统(日本);JEM-1200EX透射电镜(日本)。

1.2 动物的选取及标本制备

隔天取出生后1～30天的BALB/C小鼠，拉颈处死，分离解剖含下颌第一磨牙区的下颌骨，新鲜配制4%多聚甲醛固定过夜。自出生后5天的各标本分别用甲酸-甲酸钠复合脱钙液脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，近远中向5 um连续切片。

1.3 电镜观察

将分离的含下颌第一磨牙区的下颌骨于2.5%戊二醛固定液4℃下初固定48h，10%EDTA脱钙2周，1%锇酸后固定2小时，经梯度乙醇脱水后，换置环氧乙烷过渡。环氧乙烷:包埋剂=3∶1 1∶1 1∶3及纯包埋剂浸透，逐步过渡到Spurr包埋剂中包埋，然后升温聚合、修块切片。

2 结 果

2.1釉质分化及分泌期小鼠牙胚中间层发育过程的组织学观察

出生后1d，内釉上皮分化为高柱状的成釉细胞，紧邻成釉细胞的中间层结构清楚，由1-2层细胞组成，细胞之间连接紧密(图1)。出生后5到9天，成釉细胞呈高柱状，可见大量釉质和牙本质的分泌；中间层呈明显的单细胞结构，细胞排列紧密，与周围组织的界限清楚(图2)。出生后13天，成釉细胞继续分泌，成釉细胞高度降低；中间层细胞呈单细胞结构，细胞排列较前疏松，中间层细胞结构、与周围界限逐渐模糊(图3)。出生后15天 ，釉质分泌基本完成，牙齿部分萌出，中间层结构不易辨认(图4)。

2.2釉质分化及分泌期小鼠牙胚中间层发育电镜超微结构观察

出生后1天细胞处于分化期，中间层呈多层结构，细胞扁平状。内釉上皮细胞极化不明显，核大胞浆少(图5)。内釉上皮细胞中核分裂象多见，成釉细胞极化不明显.可见中间层胞质突起并通过桥粒连接与周围细胞相联系(图6)。中间层及成釉细胞内细胞器成分明显增多，可见大量的线粒体结构，呈卵圆形，随釉质的矿化，可变得弯曲延长，胞浆内含有大量的粗面内质网及高尔基复合体(图7、图8)。

图1 出生后3d，内釉上皮分化为高柱状的成釉细胞，紧邻成釉细胞的中间层结构清楚，由1-2层细胞组成，细胞之间连接紧密(HE, 20)。

图2 出生后5到9 天，成釉细胞呈高柱状，可见大量釉质和牙本质的分泌；中间层呈明显的单细胞结构，细胞排列紧密，与周围组织的界限清楚(HE, 20)。

图3 出生后13天，中间层细胞呈单细胞层结构，细胞排列较前疏松。(HE, 20)。

图4 出生后15d ，釉质分泌基本完成，牙齿部分萌出，中间层结构辨认不易(HE, 20)。

图5 出生后1天中间层呈多层结构，细胞呈扁平状。内釉上皮细胞极化不明显，核大胞浆少(EM, 3000)。

图6 出生后5-9天成釉细胞极化明显，中间层变为单层结构，细胞间隙变大(EM，3000)。

图7 出生后5-9天，成釉细胞和中间层联系紧密，细胞伸出长的突起，彼此间的桥粒连接明显增多(EM, 25k)。

图8 出生后5-9天，釉质分泌活跃期，成釉细胞内细胞器成分明显增多，可见大量的卵圆形的线粒体结构, 粗面内质网、高尔基复合体亦常见(EM, 25k)。

3 讨 论

牙胚发育始于牙板的建立，随后牙板上皮增厚并向其下方的间充质折入,末端膨大并诱导周围的间充质组织细胞增生、聚集,形成成釉器[2]。成釉器根据细胞分化的程度可分为三期：蕾状期、帽状期和钟状期。到钟状期时牙胚已分化出明显的四层结构：外釉上皮、内釉上皮、星网状层以及2～3层紧邻内釉上皮的鳞状细胞结构-中间层组织。Koyama等[3]对胚胎期小牛牙胚发现帽状期牙胚尖端部比较明显的釉结结构消失，取而代之的是2-3层的中间层结构，并将内釉上皮和广泛的星网状结构分开，并指出这种多细胞层的中间层组织在牙尖部及近尖端1/2的侧缘可以较明显的观察到，而在近牙胚颈部处比较薄弱，甚至缺失而不被观测到，即在牙胚颈部的内釉上皮和星网状层之间观测不到明显的中间层结构。这与我们实验中观察到的结果基本吻合。对出生后早期的牙胚光镜观察，在靠近牙胚牙尖部中间层为2-3层细胞组成的条带结构，胞核明显，呈椭圆形，而愈靠近侧缘颈部细胞层次愈薄弱，其外周为疏松的星网状层，内釉上皮呈柱状或高柱状，釉牙本质界限清楚。

中间层是牙胚发育整体中的一部分，但是有关其生物学特性和可能的功能尚不清楚。有研究表明中间层最初是作为一种多层次的上皮性组织在近釉结退化的位置逐渐出现。当釉结最终消失后，中间层在几乎全部占据其的位置上出现。在牙齿发生过程中，中间层在组织学及形态学上经历了一个暂时的变化过程。中间层的建立及其随后的一系列生物学行为都与釉结内及内釉上皮内的细胞分化有一定的相关性。中间层在牙齿从尖端至牙颈部发育过程中起到一定的导向作用，目前这种功能的具体机制尚不清楚。据此学者们间接推测中间层可能是继釉结之后的又一重要结构,细胞经历了显著的增生和退化过程,并随着成釉细胞分化程度的改变而改变。虽存在时间短暂，但在一定程度上对内釉上皮/成釉细胞的分化起到一定的诱导作用。

在实验中我们观察到前成釉细胞核内分裂相多见，细胞器成分比较少，而在釉质分泌期细胞器成分明显增多。早期牙尖部中间层细胞在内釉上皮和星网状层之间由2-3层扁平细胞组成，细胞器数量不多。到釉质分泌期，细胞间隙增大充满微绒毛，细胞器增多，细胞突起之间的桥粒连接明显增多，这种连接可以封闭上皮细胞的间隙，防止细胞外物质无选择的进入组织，保证物质转运的方向性，起到机械支持的作用。这种变化与成釉细胞的分化及釉基质的分泌有一定的相关性。中间层细胞可能参与了细胞与细胞之间的信息、营养传递，是成釉细胞的营养储备及运输细胞，在釉质形成过程中二者可视为一个功能统一体。中间层可能为釉质形成提供了一定的营养物质及矿化所需的钙、磷等物质。外釉上皮一开始是比较光滑的组织面，随之基底膜凹陷并呈多皱褶状。细胞间通过较多的桥粒及间隙连接。学者推测中间层-外釉上皮-成釉细胞层作为平行分化的结构，其形态上及时空的变化证明三者之间具有分泌、转运及支持的功能[4]。

[1] Johnson PL, Bevelander G.The role of the stratum intermedium in tooth development[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1957 Apr, 10(4): 437-443.

[2] Lumsden AG. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ[J].Development,1988, 103(Suppl): 155-169.

[3] Koyama E, Wu C, Shimo T, et al. Development of stratum intermedium and its role as a Sonic hedgehog-signaling structure during odontogenesis[J]. Dev Dyn,2001, 222(2):178-191.

[4] Matthiessen ME, Romert P .Ultrastructure of the human enamel organ. I. External enamel epithelium, stellate reticulum, and stratum intermedium[J].Cell Tissue Res,1980, 205(3): 361-370.