川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

王朝莉，李 丽，陈 果，杨尚君，敬保迁，任碧轩，冯 莉

（川北医学院分子生物学研究所，四川南充 637000）

川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

王朝莉，李 丽，陈 果，杨尚君，敬保迁*，任碧轩，冯 莉

（川北医学院分子生物学研究所，四川南充 637000）

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库，筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织，提取总RNA，逆转录cDNA，进行SSH构建消减文库获得序列标签，与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库，测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较，获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库，初步筛选胃癌部分表达基因，为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。

胃癌；SSH；特异基因

胃癌是严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤之一，我国每年有20余万例新发胃癌患者，占全部恶性肿瘤患者的17.2%，其发病率居所有恶性肿瘤发病率之首。每年胃癌患者死亡人数占所有癌症死亡人数的23.93%。由于胃癌起病隐匿，发生的确切机制至今尚不清楚，临床早期70%以上毫无症状，中晚期才引起相应的临床症状，且易转移与复发，预后极差。目前最为紧迫的是寻找对胃癌检测灵敏度高、特异性好的检测方法，使其能对胃癌高危险患者进行筛查、对早期胃癌能特异诊断、对病情发展和疗效可追踪考核，从而提前对高危患者给予干预治疗。本实验采用SSH技术，以胃低分化腺癌组织为tester，癌旁正常黏膜组织为driver，期望克隆出可能载有高度特异性目的片段，探索川东北地区胃癌不同发展阶段的基因表达变化，为进一步阐明胃癌的发病机制、开展胃癌的基因诊断和基因治疗提供重要的物质基础。

1 材料与方法

1.1 标本收集

胃癌组织和癌旁正常黏膜组织来源于川北医学院附属医院的胃癌患者，胃癌组织标本术后经川北医学院附属医院病理科鉴定为低分化腺癌。

1.2 主要化学试剂

RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA；PCR Select cDNA Subtraction试剂盒，50×PCR EnzymeMix，AdvantagePCRCloning试剂盒为美国 Clontech公司产品；NucleoSpin ExtractⅡ（Clontech）和PCR Purification（Qiagen）纯化相应产物；抑制性PCR产物以T／A方式接入pGEM-T（Promega）载体；文库扩增使用感受态大肠杆菌JM109；氨苄青霉素（50 mg／L）及显色剂X-Gal／IPTG（Gibco）筛选克隆。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的制备 取上述胃低分化腺癌和癌旁正常黏膜组织，1%PBS（含0.1%DEPC）缓冲液洗涤3次，用RNeasy Mini Kit（Qiagen）试剂盒，按使用说明提取癌组织和癌旁组织总RNA，变性琼脂糖凝胶电泳鉴定质量。

1.3.2 cDNA合成 使用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech），参照使用说明，取胃癌组织和癌旁组织总RNA各2 μl（2 μg），以RT-PCR方法扩增合成双链cDNA，产物经NucleoSpin ExtractⅡ（Clontech）纯化，琼脂糖凝胶电泳鉴定产物质量。

1.3.3 消减杂交及抑制性PCR以PCR Select cDNA Subtraction试剂盒（Clontech）进行。以限制性内切酶RsaI消化等量胃癌组织和癌旁组织cDNA，纯化并回收其产物。以酶切后的癌组织cDNA为tester，癌旁组织为driver，一份tester cDNA与Adaptor 1连接，一份tester cDNA与Adaptor 2R连接，分别将带有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA片段与等量的driver cDNA混合进行第一次消减杂交，然后将两者杂交后产物和另一份driver cDNA混合进行第二次消减杂交。

以稀释后的第二次消减杂交产物为模板，以试剂盒中的引物1进行第一轮抑制性PCR扩增，反应参数为：75℃5 min后，94℃30sec，以94℃30sec、66℃30sec、72℃1.5 min，27个循环，最后72℃6 min。再将稀释后的第一轮PCR产物作为模板，以试剂盒中的巢式PCR引物1和引物2进行第二轮PCR扩增，反应参数为：94℃30sec、68℃30sec、72℃1.5 min，20个循环。以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质量，并以PCR Purification（Qiagen）纯化PCR产物。

1.3.4 cDNA消减文库的构建、克隆与测序 将上述PCR产物与pGEM-Tasy（Promega）载体连接，转化经CaCl2处理的大肠杆菌JM109，铺于（含X-Gal，IPTG，Amp）LB平板，蓝白斑筛选和快速琼脂糖凝胶电泳方式筛选阳性克隆，随机挑选29个克隆送上海基康生物技术有限公司进行测序，以所测定的DNA序列为基准序列，通过GenBank检索和同源性分析。

2 结果

2.1 胃癌组织鉴定

本实验所用胃癌组织标本和癌旁正常黏膜组织标本均经川北医学院附属医院病理科鉴定证实。

2.2 总RNA和cDNA的合成

用Qiagen公司产总RNA快速制备试剂盒提取胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织的总RNA （图1），用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit（Clontech）合成cDNA。结果显示，无论是在胃低分化腺癌组织中还是胃正常黏膜组织中都存在相应基因的大量表达，为构建消减文库奠定基础。

2.3 胃癌特异表达基因片段的制备

以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA为tester，正常组织cDNA为driver进行SSH和抑制性PCR，产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，在200～800bp范围内的存在一系列基因片段（图2）。

2.4 胃癌cDNA消减文库的构建、测序及序列分析

经过pGEM-T载体连接的序列片段由JM109菌克隆，存在大量的阳性重组子，选取有明显条带的克隆进行序列测定，获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、 QDPR和ACTB）。

3 讨论

本实验采用SSH对胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织提取的RNA进行逆向PCR合成cDNA，产物经RsaⅠ酶切后连上接头，进行消减杂交，测序结果获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。NBPF1基因（neuroblastoma breakpoint family，member 1）：NBPF基因是一种在基因复制过程中出现相互易位产生的融合基因家族，Sherif ZA等[1]报道其与乳腺癌有关，Sossey-Alaoui K等[2]报道其与肾上腺神经节神经母细胞瘤 （Ganglioneuroblastoma）有关，Roberts T等[3]报道与恶性成神经细胞瘤有关；RXFP2基因（relaxin/insulin-like family peptide receptor 2）是松弛素家族肽受体的成员，富含亮氨酸的G蛋白偶联受体，在细胞的代谢过程中能引起cAMP的升高[4]，Halls ML等[5]报道其隐睾病和不育症有关；QDPR基因（quinoid dihydropteridine reductase）：醌型二氢喋呤还原酶基因，位于4p15.3，在BH4的循环中起关键作用，Farrugia R等[6]报道其突变会导致BH4的循环障碍，导致高苯丙氨酸血症和苯丙酮症的产生，Schochet TL等[7]报道其与青少年的吸烟有一定的关联，Lee PL[8]报道其与哺乳动物饮食中的三价铁离子的还原有一定的关系；FAM48A基因：亦称C13orf19，Kunze D等[9]和Schmidt U等[10]报道其与前列腺癌有关。以上这四种基因与胃癌的发生、发展未见相关的文献报道。ACTB基因（actin beta）：细胞骨架蛋白基因，Humar B等[11]报道其与弥散型胃癌有一定的关系。我们将深入研究这些基因的功能及其与胃癌的作用机制。

本研究采用SSH技术从整体层次对川北地区临床胃低分化腺癌组织和胃黏膜正常组织差异表达基因进行筛选，所筛选到的基因应是与胃癌的发生发展密切相关的基因，观测这些基因在胃癌发生发展中的变化，可以从分子水平揭示川北地区胃癌的发病机制，比较这些基因在胃癌和其他肿瘤中的表达变化，可以筛选到具有川北地区特异性表达的胃癌基因，可以发展川北地区对胃癌具有筛查和早期实验室诊断的方法以及具有特异性治疗和预防的手段。

[1]Sherif ZA,Danielsen M.Balanced t(11;15)(q23;q15)in a TP53+/+ breast cancer patient from a Li-Fraumeni syndrome family[J].Cancer Genet Cyt-ogenet,2006,168(1):50-58.

[2]Sossey-Alaoui K,Su G,Malaj E,et al.WAVE3,an actin-polymerization gene,is truncated and inactivated as a result of a constitutional t(1;13) (q21;q12)chromosome translocation in a patient with ganglioneuroblastoma [J].Oncogene,2002,21(38):5967-5974.

[3]Roberts T,Chernova O,Cowell JK.NB4S,a member of the TBC1 domain family of genes,is truncated as a result of a constitutional t(1; 10)(p22;q21)chromosome translocation in a patient with stage 4S neuroblastoma[J].Hum Mol Genet,1998,7(7):1169-1178.

[4]Halls ML,Bathgate RA,Summers RJ.Relaxin family peptide receptors RXFP1 and RXFP2 modulate cAMP signaling by distinct mechanisms[J]. Mol Pharmacol,2006,70(1):214-26.

[5]Halls ML,Van der Westhuizen ET,Bathgate RA,et al.Relaxin family peptide receptors--former orphans reunite with their parent ligands to activate multiple signalling pathways[J].Br J Pharmacol,2007,150(6):677-691.

[6]Farrugia R,Scerri CA,Montalto SA,et al.Molecular genetics of tetrahydrobiopterin(BH4)deficiency in the Maltese population[J].Mol Genet Metab, 2007,90(3):277-283.

[7]Schochet TL,Kelley AE,Landry CF.Differential expression of arc mRNA and other plasticity-related genes induced by nicotine in adolescent rat forebrain[J].Neuroscience,2005,135(1):285-297.

[8]Lee PL,Halloran C,Cross AR,et al.NADH-ferric reductase activity associated with dihydropteridine reductase[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,271(3):788-795.

[9]Kunze D,Fuessel S,Meye A,et al.Functional analyses of C13orf19/P38IP in prostate cell lines[J].Oncol Rep,2006,5(6):1599-1604.

[10]Schmidt U,Fuessel S,Haase M,et al.Quantification of C13orf19/P38IP mRNA expression by quantitative real-time PCR in patients with urological malignancies[J].Cancer Lett,2005,225(2):253-260.

[11]Humar B,Fukuzawa R,Blair V,et al.Destabilized adhesion in the gastric proliferative zone and c-Src kinase activation mark the development of early diffuse gastric cancer[J].Cancer Res,2007,67(6):2480-2490.

Cloning associated special genes in gastric cancer of North Sichuan Area

WANG Chaoli,LI Li,CHEN Guo,YANG Shangjun,JING Baoqian*,REN Bixuan,FENG Li
（Molecular biology research institute of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China)

Objective:To construct cDNA subtracted libraries from gastric poorly differentiated adenocarcinoma and screen differentially expressed genes.Methods:Relatively pure gastric poorly differentiated adenocarcinoma and normal gastric mucous membrance were procured,and abstracted the total RNA,and the cDNA was been reversed transcription, which was used to carry on for suppression subtractive hybridization(SSH).Subtracted cDNA fragments were linked with vector,cloned,screened,sequenced,and made homologous search.Results:The subtracted cDNA libraries were constructed with the tester of gastric poorly differentiated adenocarcinoma and the driver of normal mucosa tissue beside of the dysplasia.The sequenced result compared with the known genes of PubMed and human EST and five specificity sequences were procured(NBPF1,FAM48A,RXFP2,ACTB and QDPR).Conclusion:Subtracted cDNA libraries from gastric poorly differentiated adenocarcinoma using SSH.Some fragments have been screened and verified to help to search for novel associated genes with gastric cancer of North Sichuan Area.

Gastric cancer;Suppression subtractive hybridization;Special gene

R735.2

A

1673-7210（2011）02（b）-019-03

*通讯作者

2010-12-10）