RP-HPLC法同时测定大鼠血浆中的紫杉醇与汉防己甲素Δ

孙方迪，郭涛，侯悦，潘昊

（1.沈阳药科大学药学院，沈阳市 110016；2.沈阳军区总医院药剂科，沈阳市 110016）

RP-HPLC法同时测定大鼠血浆中的紫杉醇与汉防己甲素Δ

孙方迪1，2＊，郭涛2#，侯悦1，潘昊1

（1.沈阳药科大学药学院，沈阳市 110016；2.沈阳军区总医院药剂科，沈阳市 110016）

目的：建立同时测定大鼠血浆中紫杉醇、汉防己甲素的方法。方法：采用反相高效液相色谱法。取血浆200µL，以利血平为内标，利用乙醚提取，氮气吹干，残渣用流动相溶解，进样20μL。色谱柱为Platisisl ODS（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-0.01mol·L-1K2HPO4（30∶40∶30，磷酸调节pH值至4.5），流速为1.0mL·min-1，检测波长为227nm。结果：紫杉醇、汉防己甲素检测浓度分别在0.02～20μg·mL-1和0.02～5μg·mL-1（r分别为0.9990、0.9993）范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。紫杉醇和汉防己甲素低、中、高浓度的方法回收率分别为100.5%～104.0%和101.0%～104.8%，提取回收率分别为84.7%～93.8%和70.8%～86.0%；日内、日间精密度均＜10%。结论：本方法专属性强、操作简单、结果准确，可用于紫杉醇和汉防己甲素在大鼠体内的药动学研究。

反相高效液相色谱法；紫杉醇；汉防己甲素；药动学

紫杉醇是从紫杉树皮中提取的一种抗癌新药，由于其化学结合新颖、作用机制独特，故对其开发利用被誉为20世纪90年代抗肿瘤药三大成就之一[1]。作为新型的广谱抗肿瘤药物，紫杉醇被广泛用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤、非小细胞性肿瘤以及类风湿性关节炎的治疗[2]。现行的紫杉醇制剂（Taxol®）是将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油（Cremphor®EL）与无水乙醇1∶1的混合液中，给药前用0.9%生理盐水或5%葡萄糖溶液稀释[3]。紫杉醇注射剂虽已得到广泛的应用，但其仍存在稳定性、水溶性较差和严重过敏反应等诸多不足。口服给药是最方便的给药途径，而紫杉醇口服时却存在生物利用度极差的问题，难于经口服给药。文献[2]报道，由于胃肠道上皮细胞膜上存在P-糖蛋白（P-gp），导致紫杉醇被泵出肿瘤细胞，出现临床上的抗肿瘤药物多药耐药现象。本课题组以抗肿瘤药紫杉醇为模型药，配以P-gp抑制剂——汉防己甲素，意在改变目前临床抗肿瘤药物的多药耐药现象，并同时提高紫杉醇口服生物利用度，降低其不良反应，提高其临床使用率。本研究采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，首次建立了同时测定紫杉醇、汉防己甲素的定量分析方法，以期为进一步研究复方紫杉醇新制剂提供可行的检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HPLC系统，包括600四元梯度泵、2487型紫外检测器（美国Waters公司）；YKH-2型液体快速混合器（江西医疗器械厂）；KQ3200DE型超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）；TGL-16B型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

紫杉醇（上海金杉生物科技有限公司，批号：20070720，含量：＞99.8%）；利血平（广东邦民制药厂，批号：20050718）；汉防己甲素（西安山川生物技术有限公司，批号：20060113，含量：＞99.5%）；甲醇（色谱纯，天津四友公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

Wistar大鼠6只，♂，体重250～300g，由沈阳药科大学动物中心提供（动物生产合格证号：SCXK（辽）20033008）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Platisil（铂金）ODS（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：甲醇-乙腈-0.01mol·L-1K2HPO4（30∶40∶30，V/V/V，磷酸调节pH值至 4.5）；柱温：室温；流速：1.0mL·min-1；检测波长：227nm；进样量：20μL。

2.2 标准溶液的制备

2.2.1 药物贮备溶液的制备 分别精密称取紫杉醇、汉防己甲素10.00、5.00mg，分别用甲醇溶解并分别定容至50、100mL容量瓶中，制备成200μg·mL-1的紫杉醇贮备液和50μg·mL-1的汉防己甲素贮备液，4℃贮藏，备用。

2.2.2 内标贮备溶液的制备：精密称取利血平5.00mg，用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成100μg·mL-1的内标贮备液，用时稀释成25μg·mL-1的内标工作液，4℃贮藏，备用。

2.3 样品处理

取血浆样品0.2mL，加内标溶液20µL（25μg·mL-1），涡旋1min，加入3mL乙醚涡旋5min，4000r·min-1离心10min，将上层乙醚液移取至干净的5mL离心管中，置于40℃水浴中用氮气吹干，残渣用100μL的流动相溶解后取20μL进样。结果表明，在“2.1”色谱条件下，紫杉醇、汉防己甲素和利血平分离良好，峰形尖锐，无拖尾现象；血中内源性物质对测定无干扰。大鼠血浆色谱见图1。

图1 大鼠血浆色谱图A.空白血浆；B.紫杉醇、汉防己甲素标准品+内标空白血浆；C.血浆样品；1.紫杉醇；2.汉防己甲素；3.利血平Fig1 HPLC chromatograms of rats plasmaA.blank plasma；B.paclitaxel and tetrandrine standard+blank plasma；C.plasma sample；1.paclitaxel；2.tetrandrine；3.crystoserpine

2.4 标准曲线的制备

取大鼠血0.2mL，分别加紫杉醇、汉防己甲素系列标准溶液20μL，配制成紫杉醇浓度为0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20μg·mL-1和汉防己甲素浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg·mL-1的血浆样品，按“2.3”项下方法操作，取20μL进样分析。以血浆样品中药物峰面积与内标峰面积之比（A）为纵坐标，药物浓度（c）为横坐标，进行线性回归，得紫杉醇回归方程为A＝0.281c+0.023（r＝0.9990）、汉防己甲素回归方程为A＝0.535c+0.009（r＝0.9993）。结果表明，紫杉醇血药检测浓度在0.02～20μg·mL-1、汉防己甲素血药检测浓度在0.02～5μg·mL-1范围内同其与内标峰面积比值呈良好线性关系。紫杉醇和汉防己甲素最低检测浓度均为0.01μg·mL-1。

2.5 回收率试验

2.5.1 提取回收率试验 取大鼠空白血浆0.2mL（18份），配制高、中、低浓度（紫杉醇浓度为20、1、0.05μg·mL-1，汉防己甲素浓度为5、0.5、0.05μg·mL-1）的血浆样品各6份，按“2.3”项下方法操作，评价提取回收率。提取回收率试验结果见表1。

2.5.2 方法回收率试验 取“2.5.1”项下的高、中、低浓度血浆质控样品，评价方法回收率。方法回收率试验结果见表1。

由表1可知，高、中、低浓度的样品提取回收率均＞70%，高、中、低浓度的方法回收率结果的RSD均＜5%，说明该分析方法的回收率满足体内分析的要求。

2.6 精密度试验

取大鼠空白血浆0.2mL，按“2.5”项下方法制备高、中、低浓度（紫杉醇浓度为20、1、0.05μg·mL-1，汉防己甲素浓度为5、0.5、0.05μg·mL-1）的质量控制样品，分别在同一天内测定 5次，计算日内精密度；并连续测定5d，计算日间精密度。精密度试验结果见表2。

表1 回收率试验结果（±s，n＝6）Tab1 Results of recovery tes（t±s，n＝4）

表1 回收率试验结果（±s，n＝6）Tab1 Results of recovery tes（t±s，n＝4）

成分 c/μg·mL-1紫杉醇汉防己甲素0.051.0020.000.050.505.00提取回收率/%84.7±2.991.7±1.193.8±1.570.8±2.577.9±1.986.0±2.2方法回收率/%102.7±3.7104.0±3.1100.5±2.2101.0±4.7104.5±2.8104.8±2.4

表2 精密度试验结果（n＝5）Tab2 Results of precisions test（n＝5）

由表2可知，高、中、低浓度的血浆质控样品的日内和日间RSD均＜10%，说明本分析方法的日间、日内精密度满足要求。

2.7 样品稳定性试验

取空白血浆200μL，分别加入不同量的紫杉醇和汉防己甲素，制备高、中、低浓度（紫杉醇浓度为20、1、0.05μg·mL-1，汉防己甲素浓度为5、0.5、0.05μg·mL-1）的溶液，充分混匀，按“2.3”项下方法操作，分别在室温条件放置不同时间（0、4、8h）、冻融条件（反复冻融3次）下进行HPLC测定。结果表明，紫杉醇、汉防己甲素在室温和冻融条件下稳定性良好，浓度未发生明显变化，高、中、低浓度的RSD均＜10%。

2.8 动物实验

取Wistar大鼠6只，ig给予自制复方紫杉醇制剂，给药后分别于0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24h，后眼眶静脉丛穿刺取血0.5mL，分离得到的血浆样品经预处理后进行HPLC测定。结果表明，紫杉醇和汉防己甲素的血药浓度值均在标准曲线的定量范围内。血药浓度-时间曲线见图2。

3 讨论

关于紫杉醇的血药浓度测定方法已有很多报道，但同时测定血浆中紫杉醇与汉防己甲素含量的研究却未见报道。由于紫杉醇紫外吸收波长较低，受内源性物质干扰较大，因此有文献报道用固相萃取柱[4]进行提取分离，但成本较高。另有文献报道用叔丁基甲醚[5～8]、乙酸乙酯[9]、二氯甲烷[10]提取紫杉醇，

图2 血药浓度-时间曲线Fig2 Plasma concentration-time profile of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma

但是内源性物质干扰很严重。本研究采用乙醚为提取溶剂，经过液-液萃取，方便、快捷，内源性物质不干扰药物的测定，且提取回收率较高。

本研究所建立的HPLC法简便、快速、分离效果好、成本低、准确度和精密度好、回收率和灵敏度高，可用于紫杉醇、汉防己甲素在大鼠体内的血药浓度测定，为临床合理用药提供理论依据。

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Simultaneous Determination of Paclitaxel and Tetrandrine in Rats Plasma by HPLC

SUN Fang-di，HOU Yue，PAN Hao
（School of Pharmacy，Shenyang Parmaceutical University，Shenyang 110016，China）
SUN Fang-di，GUO Tao
（Dept.of Pharmacy，General Hospital of Shenyang Military Region，Shenyang 110016，China）

OBJECTIVE：To establish the RP-HPLC method for the simultaneous determination of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma.METHODS：With crystoserpine as the internal standard，the plasma sample 200µL was extracted with ether，evaporated under gentle N2stream and the residual was resolved with mobile phase.The samples were separated on Platisil ODS（250mm×4.6mm，5μm）column with a mobile phase of methol-acetonitrile-0.01mol·L-1dipotassium hydrogen phosphate（30∶40∶30，pH adjusted to 4.5with phosphoric acid）at the flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 227nm.RESULTS：The linear ranges were 0.02～20μg·mL-1（r＝0.9990）for paclitaxel and 0.02～5μg·mL-1（r＝0.9993）for tetrandrine.The method recovery was 100.5%～104.0%and 101.0%～104.8%and the extraction recovery was 84.7%～93.8%and 70.8%～86.0%，respectively.The RSD of intra-day and inter-day both were less than 10%.CONCLUSION：The method is specific，simple，accurate and reproducible for pharmacokinetics study of paclitaxel and tetrandrine in rats plasma.

RP-HPLC；Paclitaxel；Tetrandrine；Pharmacokinetics

#通讯作者：主任药师，博士研究生导师。研究方向：中西药制剂、临床药学。E-mail：sy-guotao@263.net

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2011）19-1737-03

Δ中国博士后科学基金资助项目（20060390978）

＊硕士研究生。研究方向：中药新剂型。电话：024-28851435。E-mail：sunfangdi@sohu.com

2010-06-12

2010-12-09）