康脑液2号对脑缺血再灌注大鼠VEGF、Ang-1与微血管密度的影响Δ

梁起保，邹玉安，张晓丽，薛茜#，石会娟，李瑞羽

（1.河北北方学院，张家口市 075000；2.河北北方学院第一附属医院神经内科，张家口市 075000；3.河北张家口市电力物业管理公司门诊部，张家口市 075000）

康脑液2号对脑缺血再灌注大鼠VEGF、Ang-1与微血管密度的影响Δ

梁起保1＊，邹玉安2，张晓丽1，薛茜2#，石会娟1，李瑞羽3

（1.河北北方学院，张家口市 075000；2.河北北方学院第一附属医院神经内科，张家口市 075000；3.河北张家口市电力物业管理公司门诊部，张家口市 075000）

目的：研究康脑液2号对脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）与微血管密度（MVD）的影响。方法：180只雄性SD大鼠随机均分为正常组、假手术组、模型组与康脑液2号高、中、低剂量组。线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉闭塞模型。大鼠缺血2h，于再灌注1、3、7、14、21d，免疫组化法检测各组大鼠VEGF、Ang-1的表达，HE染色观察大鼠脑组织病理改变；再灌注21d后免疫荧光法标记细胞膜糖蛋白CD105，观察新生血管，计算MVD。结果：与模型组比较，康脑液2号高、中、低剂量组病理变化更显著，VEGF、Ang-1在每个时间点表达显著增高，脑梗死周围区域MVD显著增大。结论：康脑液2号能改善脑缺血再灌注大鼠病理变化，保护梗死区域神经细胞，其机制可能与增加VEGF、Ang-1等促血管新生因子表达而促进脑坏死周围区域血管新生有关。

康脑液2号；脑缺血再灌注损伤；血管内皮生长因子；血管生成素-1；微血管密度

脑卒中是临床常见疾病，在当今生活及饮食习惯的影响下，该病有上升趋势，是世界范围内主要致死和致残的疾病之一。脑血管疾病在我国是位居第三的致死因素，其中缺血性脑血管病（Ischemic cerebrovascular disease，ICVD）可占到56.6%～80%，患者总人数可达500万～600万，存活者有高致残率，高达约75%[1]，故对ICVD的防治非常重要。本课题组主要通过研究经验方康脑液2号对脑缺血再灌注大鼠血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）与微血管密度（MVD）的影响来探索其对脑缺血再灌注大鼠的治疗机制，从而为康脑液2号防治ICVD提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电脑生物组织包埋机、电脑生物组织摊烤片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；石蜡切片机、自动脱水机（美国Thermo公司）；BX60型光学显微镜（日本Olympus公司）；显微摄影装置、E200型荧光显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 试药

康脑液2号由黄芪、当归、川芎、三七、葛根、地龙、丹参、钩藤（后下）等药味组成（药材购于河北北方学院第一附属医院，经河北北方学院第一附属医院薛茜副主任医师鉴定为真品），冷水浸泡过夜，煎煮2次，滤出药渣，将2次煎取的药液混匀，文火分别浓缩成400%、200%、100%康脑液2号（每1mL分别含生药4、2、1g），4℃贮藏，备用；多聚甲醛（美国Sigma公司）；大脑中动脉阻塞（MCAO）栓线（北京沙东生物技术有限公司）；兔抗大鼠一抗体及相应二抗、荧光TRITC标记的羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 动物

SPF级成年SD大鼠180只，♂，体重200～280g，购自北京大学医学部动物中心（动物使用许可证号：SCXK（京）2006-0008）。

2 方法

2.1 模型的复制

根据Longa EZ等[2]改良的方法，线栓经右侧颈外动脉插线建立右侧MCAO法复制大脑缺血再灌注模型。

2.2 分组与给药

将大鼠随机分为正常（等体积生理盐水）、假手术（等体积生理盐水）、模型（等体积生理盐水）与康脑液2号高、中、低剂量（28.6、14.3、7.15g·kg-1）组，缺血2h，从手术后12h开始ig给药，每天1次，直至处死。

2.3 HE染色与VEGF、Ang-1蛋白标记

于再灌注每个时间点，取每组6只大鼠，10%水合氯醛（300mg·kg-1）ip麻醉，经左心室插管至升主动脉，依次灌入生理盐水150mL、4%多聚甲醛200mL，前肢固定至肢体变硬，开颅取脑，于前囟前2mm至前囟后3mm切脑，切块厚度5mm，置入4%多聚甲醛中固定12～24h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。切片3µm，HE染色观察脑梗死后病理变化，采用免疫组化法（S-P二步法，按说明操作）检测VEGF及Ang-1蛋白表达。

2.4 MVD检测

于再灌注后21d，TRITC标记细胞膜糖蛋白CD105显示新生血管，简要步骤如下：切片脱蜡至水，PBS冲2min×3，室温5%BSA封闭10min，甩去多余液体，滴加CD105一抗，4℃过夜，PBS冲3min×3，加TRITC标记的二抗（1∶64），37℃1h，PBS冲洗2min×4，裱片，甘油封片。在发射波长550nm、滤光波长620nm荧光显微镜下观察。切片经图像分析仪分析系统处理，参照Weidner N[3]的方法进行MVD计数，每份标本均选5个高倍视野（200×）计数微血管数目，取平均值为该份标本的平均微血管数（MMVC），以MMVC/mm2表示MVD（200×/高倍视野等于0.0426mm2）。

2.5 统计学方法

实验结果采用SPSS16.0版本进行处理，每组数据以±s表示。采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较用SNK法，P＜0.05为差异显著。

3 结果

3.1 各组大鼠脑病理改变情况

光镜下可见模型组梗死明显，梗死主要位于基底节、皮质下白质和皮层，缺血区神经细胞明显减少，残存神经细胞胞体缩小变性，细胞核固缩，胞浆浓缩呈深伊红染色，神经元纤维疏松，间质水肿明显，血管减少。康脑液2号低剂量组可见梗死范围缩小，水肿程度较轻，神经元形态改变也较轻，胞体完整，突起较清楚，基本保持完整，血管较模型组明显增多。大鼠脑病理改变见图1。

图1 大鼠脑病理改变（HE，×100）A.正常组；B.康脑液2号低剂量组；C.模型组Fig1 Pathological change of cerebral tissue in rats（HE，×100）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

3.2 脑组织VEGF与Ang-1免疫组化结果

VEGF与Ang-1阳性表达可见胞浆呈棕黄色，可表达于神经细胞、胶质细胞与血管内皮细胞。正常组和假手术组表达较弱，模型组VEGF与Ang-1蛋白表达显著增强（P＜0.01或

P＜0.05）。与模型组比较，康脑液2号高、中、低剂量组VEGF

与Ang-1表达显著增高（P＜0.01或P＜0.05），VEGF表达高峰在7d，Ang-1表达高峰在14d。康脑液2号高、中剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05）。大鼠VEGF的表达结果见表1、图

2；大鼠Ang-1的表达结果见表2、图3。

3.3 大鼠脑MVD检测结果

表1 大鼠VEGF的表达结果（±s）Tab1 Expression of VEGF in cerebral tissue of rat（s±s）

表1 大鼠VEGF的表达结果（±s）Tab1 Expression of VEGF in cerebral tissue of rat（s±s）

与正常组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组假手术组模型组康脑液2号高剂量组康脑液2号中剂量组康脑液2号低剂量组21d 5.35±2.785.45±2.4217.11±2.81＊＊22.32±2.33#22.13±2.19#19.20±2.96#VEGF/个数n 6666661d 5.34±2.815.86±2.439.23±2.45＊10.25±2.3310.36±2.3110.25±2.013d 5.35±2.245.97±1.8816.35±3.18＊＊29.25±4.04##28.96±3.88##22.66±3.32##7d 5.35±2.876.16±2.3232.51±3.54＊＊54.37±4.65##55.09±4.74##48.22±3.09##14d 5.36±2.015.88±1.2920.19±3.21＊＊34.52±4.21##33.82±4.02##30.01±3.89##

阳性血管表达呈红色。正常组与假手术组阳性血管表达较少；模型组MVD显著高于正常组（P＜0.01）。与模型组比较，康脑液2号高、中、低剂量组MVD显著增高（P＜0.01或P＜0.05），康脑液2号高、中剂量组促血管新生能力显著强于低剂量组（P＜0.05）。大鼠脑MVD的比较结果见表3；大鼠新生血管的表达见图4。

4 讨论

图2 大鼠VEGF的表达（免疫组化，×400）A.正常组；B.康脑液2号低剂量组；C.模型组Fig2 Expression of VEGF in cerebral tissue of rats（immunohistochemistry，×400）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

脑缺血后引起一系列的级联反应，包括炎症反应、自由基超载、毒性氨基酸释放等，但归根结底无非是脑缺血缺氧导致，如果能早期恢复血供则可实现让脑组织自己搭桥的梦想。临床工作中早期组织型纤溶酶原激活剂（T-PA）溶栓显示出较好的临床效果，证实了及时恢复血供、建立侧枝循环对治疗脑缺血的重要性。但T-PA溶栓指征苛刻，临床上适合溶栓的患者非常少，所以开发能促进脑缺血周围组织血管新生的药物成为治疗ICVD的重要策略。血管新生是在缺血组织已有的血管床上，内皮细胞以牙生的方式长出新支，形成血管网，使其功能与局部的需要相适应的生物学过程，主要靠促血管新生因子来促使其生成。VEGF是迄今发现最重要的一种促血管生成因子，其一方面能高选择地促进血管内皮的有丝分裂，进而促进血管内皮的新生；另一方面，其还能增加血管内皮的通透性，使血浆大分子物质渗透到血管外的基质中，从而为新生的血管提供营养物质[4]。Ang-1在血管新生过程中也发挥着重大作用，主要机制如下：（1）使血管内皮细胞趋化、聚集，吸引周围细胞形成新生血管；（2）拮抗内皮细胞凋亡；（3）促进血管内皮细胞迁移和形成管状结构，加强VEGF等的血管稳定作用；（4）调节内皮细胞和血管平滑肌细胞，促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性和稳定性[5]。

表2 大鼠Ang-1的表达结果（±s）Tab2 Expression ofAng-1in cerebral tissue of rat（s±s）

表2 大鼠Ang-1的表达结果（±s）Tab2 Expression ofAng-1in cerebral tissue of rat（s±s）

与正常组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组假手术组模型组康脑液2号高剂量组康脑液2号中剂量组康脑液2号低剂量组Ang-1/个数n 6666661d 5.06±3.015.16±2.108.24±2.54＊8.26±2.528.36±2.488.25±2.013d 5.05±2.225.17±1.9811.25±3.63＊＊19.96±3.64##19.26±3.69##18.64±3.22##7d 5.05±2.975.16±2.5513.88±3.21＊＊20.08±3.55##20.19±3.64##18.22±3.17##14d 5.08±2.215.18±1.2920.19±5.01＊＊41.54±5.11##40.02±5.12##32.01±4.62##21d 5.06±2.965.15±3.1212.11±3.21＊＊14.21±2.22#14.22±2.28#14.20±2.21#

图3 大鼠Ang-1的表达（免疫组化，×400）A.正常组；B.康脑液2号低剂量组；C.模型组Fig3 Expression of Ang-1in cerebral tissue of rats（immunohistochemistry，×400）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

表3 大鼠脑MVD的比较结果（±s，血管数/mm2）Tab3 Comparison of MVD in cerebral tissue of rat（s±s，MMVC/mm2）

表3 大鼠脑MVD的比较结果（±s，血管数/mm2）Tab3 Comparison of MVD in cerebral tissue of rat（s±s，MMVC/mm2）

与正常组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组假手术组模型组康脑液2号高剂量组康脑液2号中剂量组康脑液2号低剂量组n 666666缺血再灌注21d 8.13±0.987.98±1.4338.22±3.25＊50.39±4.80##50.20±4.66##44.11±4.24#

图4 大鼠新生血管的表达（×100）A.正常组；B.康脑液2号低剂量组；C.模型组Fig4 Expression of CD105of rats（×100）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

CD105不与大血管的内皮细胞反应，但对新生血管反应性强，即与“活化”的内皮细胞反应性强，而对组织中正常的静止状态下的血管内皮细胞反应性弱[6]。本研究利用免疫荧光标记技术标记CD105，能更好地显示新生血管，更具有说服力。

ICVD属于中医的中风范畴，其主要病机为“素体气虚，不能行血，以致血瘀”，所以治疗原则主要为“益气活血化瘀”。康脑液2号是临床使用多年的经验方，适合气虚血瘀患者，由益气活血的鼻祖方补阳还五汤按照现代人的特点化裁而来，由黄芪、当归、川芎、葛根、地龙、三七、丹参、钩藤等组成。方中君药以大量黄芪大补脾胃元气，使得气旺血行，瘀去络通，并且活血祛瘀而不伤正；当归善于活血养血，有化瘀而不伤血之妙，并和黄芪1∶5配伍为当归补血汤，充养脉络，是为臣药；川芎、葛根、地龙、三七、丹参等助当归活血化瘀，为佐药；钩藤、天麻引药上行，是为使药，君臣佐使共奏补气活血化瘀之功。益气活血法治疗缺血再灌注损伤研究较多，严彬等[7]利用补气活血中药治疗肾缺血再灌注模型大鼠，效果较好。更有田兆华等[8]研究证实，益气活血代表方补阳还五汤能明显增多缺血脑组织新生血管数目。其余各单药对脑梗死的治疗作用也均有研究，有的已经在临床使用，比如川芎、丹参、葛根、三七等。

综上所述，康脑液2号能增加MCAO大鼠VEGF、Ang-1的表达，促进缺血脑组织血管新生，这可能是康脑液2号治疗ICVD的机制所在。

[1] Jia Q，Liu LP，Wang YL.Stroke in China[J].Clin Exp Phar-macol Physiol，2010，37（2）：259.

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[3] Weidner N.Intratumor microvessle density as a prognostic factor in cancer[J].Am J Pathol，1995，147（1）：9.

[4]WangYQ，GuoX，QiuMH，et al.VEGF overexpression enhances stria-talneurogenesis in brain of adult rat after a transientmiddle cerebral artery occlusion[J].J Neurosci Res，2007，85（1）：73.

[5] 刘 帅，刘学政.Ang-1/Tie2系统与病理性血管形成的关系[J].解剖科学进展，2010，16（1）：85.

[6] 于建宪，常 宏，纪 萍.CD105、CD34及Ⅷ因子在不同生理状态下子宫内膜中的表达[J].齐鲁医学杂志，2005，20（3）：189.

[7] 严 彬，王建华，王旭东，等.补气活血中药对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用研究[J].中国药房，2005，16（9）：658.

[8] 田兆华，刘柏炎.补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血管新生的影响[J].中国动脉硬化杂志，2010，18（3）：193.

Effects of Kangnao Liquid Ⅱ on VEGF，Ang-1and MVD of Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LIANG Qi-bao，ZHANG Xiao-li，SHI Hui-juan
（Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）
ZOU Yu-an，XUE Qian
（Dept.of Neurology，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）
LI Rui-yu
（Outpatient Department of Zhangjiakou Power Estate Management Company of Hebei Province，Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTIVE：To investigate the influences of Kangnao liquid Ⅱ on vascular endothelial growth factor（VEGF），angiogenin-1（Ang-1）and MVD in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.METHODS：180healthy male SD rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group，Kangnao liquid Ⅱ high-dose，medium-dose and low-dose groups.Middle cerebral artery occlusion model was induced using suture method.Pathological changes were detected by HE staining and immunohistochemical method was used to investigate the expression of VEGF and Ang-1in rats on 1d，3d，7d，14d，21d of reperfusion injury after ischemia for 2h.Immunofluorescence labeling method was used to mark neovascular CD105after 21d of reperfusion and calculate MVD.RESULTS：Compared with model group，pathological changes of Kangnao liquidⅡhigh-dose，medium-dose，low-dose groups was better than that of model group.The expressions of VEGF and Ang-1increased at different time points significantly.MVD of cerebral infarction area was significant bigger than that of model group.CONCLUSION：Kangnao liquidⅡcan improve pathological change of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and protect nerve cells of cerebral infarction focus.It may be associated with Kangnao liquidⅡcan increase the expression of VEGF and Ang-1to promote tissue angiogenesis.

Kangnao liquidⅡ；Cerebral ischemia reperfusion injury；Vascular endothelial growth factor；Angiogenin-1；MVD

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1740-04

Δ河北省医学科学研究重点课题（20090591）

＊硕士研究生。研究方向：缺血性脑血管疾病的用药。E-mail：liangqibaoyisheng@126.com

#通讯作者：副主任医师，副教授。研究方向：缺血性脑血管疾病。E-mail：xueqian6166@163.com

2010-10-17

2011-01-19）