固相萃取-HPLC法测定MCF-7细胞内、外液中多西他赛的含量

柯昌毅，车坷科，王丽娟

（1.重庆市第三人民医院，重庆市 400014；2.重庆医药高等专科学校，重庆市 400030）

固相萃取-HPLC法测定MCF-7细胞内、外液中多西他赛的含量

柯昌毅1＊，车坷科1，王丽娟2

（1.重庆市第三人民医院，重庆市 400014；2.重庆医药高等专科学校，重庆市 400030）

目的：建立测定人乳腺癌细胞MCF-7内、外液中多西他赛（DOC）含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。分别制备细胞内液和细胞外液样品，经三氯乙酸除蛋白，固相萃取柱提取，色谱柱为Symmetry-C18，柱温为30℃，流动相为醋酸盐缓冲液（pH5.0）-乙腈＝50∶50，检测波长为230nm。结果：DOC在细胞内、外液中检测浓度线性范围均为0.05～5.50μg·mL－1（r＝0.9993、r＝0.9990），平均提取回收率（n＝5）均大于94%，日内、日间RSD（n＝5）均小于5%，最低检测限分别为0.05、0.03μg·mL－1；细胞内液中DOC含量远高于细胞外液。结论：本方法简便、灵敏、干扰小，可用于MCF-7细胞内、外液中DOC含量的测定。

多西他赛；人乳腺癌细胞MCF-7；细胞内液；细胞外液；固相萃取-高效液相色谱法；含量测定

多西他赛（Docetaxel，DOC），又名多西紫杉醇，是作用于细胞周期（M期）的特异性抗肿瘤药，可促进小管聚合成为稳定的微管，并抑制其解聚，使游离小管的数量显著减少，同时通过破环微管的网状结构，抑制细胞有丝分裂从而达到抗肿瘤目的[1，2]。其抗瘤谱较紫杉醇广，是目前临床上治疗转移乳腺癌（MBC）和非小细胞肺癌（NSCLC）最有效的单剂化疗药物[3]。为了定量测定DOC在细胞内、外液中的含量，本研究采用固相萃取（SPE）法快速提取人乳腺癌细胞株MCF-7样品中的DOC，并建立其含量测定的高效液相色谱（HPLC）方法。结果表明，该方法简便、灵敏、干扰小，可进一步用于DOC在人体细胞内、外药动学的相关研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HPLC系统（美国Waters公司）；BF2000氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；BPN-80CRH二氧化碳培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；TGL-16高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SK-1型快速混匀器（上海沪西分析仪器厂）；KQ-500B型超声仪（昆山超声波仪器有限公司）；828型酸度计（美国奥力龙公司）；固相萃取仪（美国Agilent公司）；Bond-Elut C18固相萃取柱（美国瓦力安公司）。

1.2 试药

DOC标准品（中国药品生物制品检定所，批号：1642-200810，含量：≥95.5%）；RPMI-1640培养基（北京清大天一生物技术有限公司）；细胞培养用小牛血清（上海纬群生物技术有限公司）；乙腈为色谱纯；碳酸氢钠、磷酸二氢钾、醋酸铵、冰醋酸、三氯乙酸均为分析纯；试验用水为超纯水。

1.3 细胞株

人乳腺癌细胞株MCF-7（上海沪峰生物科技有限公司，细胞系编号：CY20201）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters symmetry-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：醋酸盐缓冲液（0.02mol·mL－1的醋酸铵，醋酸调pH 5.0）-乙腈＝50∶50（V/V）；柱温：30℃；检测波长：230nm；流速：1mL·min－1；进样体积：20μL。

2.2 标准溶液、细胞内液及细胞外液样品的制备

2.2.1 标准贮备液的制备。在避光条件下，精密称取DOC标准品0.50mg置于10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，得50μg·mL－1贮备液，置于2～8℃冰箱中备用。

2.2.2 细胞内液及细胞外液样品的制备。复苏冷冻保存的MCF-7细胞株，将其接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，置于饱和湿度下5%CO2培养箱中，37℃培养48h。取对数生长期的MCF-7细胞用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后加入0.25%的胰蛋白酶3mL消化细胞，1000r·min－1离心10min，加入一定量的培养液，调整细胞密度为2×106个/L。取细胞培养瓶，每瓶加入MCF-7细胞悬浮液2mL，再加入培养液6mL，置于饱和湿度下5%CO2培养箱中37℃培养24h。弃掉原培养液，分别加入质量浓度为0.10、1.00、5.00μg·mL－1DOC的培养液（含0.05%吐温-80），药物作用48h后停止培养。以1000r·min－1离心10min，分离细胞和培养液（得细胞外液）[4]。将细胞用生理盐水反复冲洗3次，弃去洗涤液，再用生理盐水制备成细胞密度为1×106个/L的悬浮液（得细胞内液），于－80℃冰箱中冷冻保存。

2.3 样品的预处理与测定

首先将Bond-Elut C18固相萃取柱用3mL甲醇活化，3mL 0.01mol·L－1（pH5.0）的醋酸铵平衡。

将置于－80℃冰箱中冻存的上述MCF-7细胞内液样品及细胞外液样品反复冻融5次，使其充分裂解。分别取冻融后的细胞外液或细胞内液200μL分装于2mL的EP管中，再分别加1%三氯乙酸250μL，涡漩1min，离心（13000r·min－1）10min，吸取上清液700μL分别收集于10mL EP管中，加入等体积0.01mol·L－1（pH5.0）的醋酸铵，混匀，注入已活化的固相小柱中，常压下依次用0.01mol·L－1（pH5.0）的醋酸铵2mL，20%甲醇-醋酸铵（0.01mol·L－1，pH5.0）2mL过柱，抽干小柱，1mL乙腈洗脱并收集洗脱液，N2吹干，200μL流动相复溶，混匀，取20μL进样，记录峰面积，以外标法定量[5]。

2.4 专属性考察

在选定的色谱条件下，考察了DOC标准品、空白细胞内液、空白细胞外液、空白细胞内液+标准品、空白细胞外液+标准品及含药细胞内、外液样品的色谱分离情况，色谱见图1。

综合考虑样本国家的地域位置、经济状况、文化以及数学教育背景等因素，除中国之外选取了5个代表性国家：澳大利亚、英国、新加坡、美国、南非（选取的6个国家以国家代码首字母进行排序，分别是澳大利亚、中国、英国、新加坡、美国、南非），6个国家基础教育阶段主体学制以及研究选取的国家数学课程标准文本如下（为了全文行文一致，各国均根据学制按年级顺序排列）．

由图1可知，峰1为DOC，保留时间约为6.18min，DOC与细胞杂质及培养液杂质均达到基线分离（R＞1.5），峰形对称。

2.5 标准曲线的制备

2.5.1 细胞内液。取数份200μL空白细胞内液，分别加入不同体积的DOC标准贮备液，制备成浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50μg·mL－1的标准品各5份，按“2.3”项下方法处理后，进样测定，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，DOC浓度X为横坐标建立标准曲线，得细胞内液中DOC的回归方程为Y＝7549X－199.4（r＝0.9993），最低检测限为0.05μg·mL－1（S/N＝3）。

2.5.2 细胞外液。取数份200μL空白细胞外液，分别加入不同体积的DOC标准贮备液，制备成浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.50、3.50、4.50、5.50μg·mL－1的标准品各5份，按“2.3”项下方法处理后，进样测定，记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，DOC浓度X为横坐标建立标准曲线，得细胞外液中DOC的回归方程为Y＝10894X－277.1（r＝0.9990），最低检测限为0.03μg·mL－1（S/N＝3）。

图1 高效液相色谱图a.DOC标准品（1.5μg·mL－1）；b.空白细胞内液；c.空白细胞外液；d.空白细胞内液+标准品（1.0μg·mL－1）；e.空白细胞外液+标准品（1.0μg·mL－1）；f.含药细胞内液（0.10μg·mL－1）；g.含药细胞外液（0.10μg·mL－1）；1.DOCFig1 HPLC chromatogramsa.standard substance of DOC（1.5μg·mL－1）；b.blank intracellular fluid；c.blank extracellular fluid；d.blank intracellular fluid+substance control（1.0μg·mL－1）；e.blank extracellular fluid+substance control（1.0μg·mL－1）；f.intracellular fluid sample（0.10μg·mL－1）；g.extracellular fluid sample（0.10μg·mL－1）；1.DOC

2.6 回收率试验

制备浓度为0.10、2.00、5.00μg·mL－1的DOC细胞内液标准品及细胞外液标准品各5份，按“2.3”项下方法处理，进样；另用流动相制备相对应浓度DOC标准品溶液，取相同进样体积供HPLC分析，分别记录峰面积，计算MCF-7细胞内液及细胞外液中DOC的提取回收率，结果见表1。

表1 MCF-7细胞内液和外液中DOC的提取回收率（n＝5）Tab1 Extraction recoveries of DOC in extracellular and intracellular fluid of MCF-7cell（n＝5）

由表1可见，提取回收率均大于94%。

2.7 精密度试验

制备DOC浓度为0.10、2.00、5.00μg·mL－1的MCF-7细胞内液及细胞外液标准品各5份，按“2.3”项下方法处理后，进样20μL，于同日内测定5次，并连续测定5d，记录样品峰面积，按回归方程计算对应浓度，计算其日内和日间精密度，结果见表2。

表2 精密度试验结果（n＝5）Tab2 Results of precision tests（n＝5）

由表2可见，日内、日间RSD均小于5%。

2.8 稳定性试验

试验结果表明细胞样品室温放置24h内仍较稳定，并且可于冻存条件下保存至少3周。

2.9 样品中DOC的含量测定

取浓度为0.10、1.00、5.00μg·mL－1DOC的样品细胞内液和细胞外液样品各200μL，按“2.3”项下方法处理后，进样20μ L，结果见表3。

表3 样品中DOC的含量测定结果（n＝3）Tab3 Results of content determination of DOC in different samples（n＝3）

3 讨论

[6～8]中DOC的提取方法，较多采用有机溶剂萃取法，回收率都高于90%；本研究曾试验了有机溶剂萃取法，结果显示样品提取回收率低于50%，可能是由于本试验中样品浓度较低所致，因此，本试验采用了简单、快速、回收率高且杂质少的SPE法作为DOC的提取方法。

根据文献[9]分别选择正己烷、乙酸乙酯、水和醋酸铵溶液4种溶媒作为洗脱剂，结果表明，醋酸铵的弱酸性条件有利于杂质的吸附，且易被洗脱。因此，本试验采用三氯乙酸沉淀蛋白后，以醋酸铵、20%甲醇-醋酸铵为洗脱剂，乙腈富集样品。本试验还比较了将细胞内、外液样品反复冻融与不冻融之间样品杂质量的差异，结果表明反复冻融5次后的样品杂质明显比不经过冻融的少。

根据文献[7，8]曾采用乙腈-水体系作为流动相，结果表明无论二者比例如何变化，均不能使DOC与杂质峰分离。当采用甲醇-0.02mol·L－1醋酸钠缓冲液（冰醋酸调pH值至5.0）时虽然可以达到分离的目的，但DOC保留时间较长且峰形较差[10]。因此，本试验采用醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，结果，DOC与杂质峰达到基线分离（R＞1.5），保留时间约为6min，且色谱中DOC峰峰形良好。

DOC具有高度的亲脂性，水溶性差，在水里几乎不溶解，如直接将含乙腈的DOC贮备液用于MCF-7细胞培养则会产生细胞毒性，从而干扰细胞的正常生长。在参考市售药品后采用与其含有相同成分的吐温-80作助溶剂，以增加DOC在培养液中的溶解度，其制备的药物中吐温-80的终浓度为0.05%，与宁方玲等[11]的研究近似。

在表3中，细胞内液与细胞外液中检测出的DOC含量相比相差较大，笔者分析是由于DOC对MCF-7细胞有较好的亲合力，大量DOC得以进入细胞内所致。因而，本试验的结果显示细胞内液中DOC的含量远高于细胞外液。同时，也从侧面印证了DOC是针对乳腺癌具有较好疗效的化疗药物。

参考文献

[1] 卫生部合理用药专家委员会.中国医师药师临床用药指南[M].重庆：重庆出版社，2009：374、375.

[2] Horrowitz SB.Mechanism of action of Toxol[J].Trends Pharmacol Sci，1992，13（4）：134.

[3] SchneeweissA，Lenz F，Beldermann F，et al.Taxane-based palliative chemotherapy for metastatic breast cancer：matched pair analysis to compare the efficiacy and safety of docetaxel and paclitaxel[J].Zentralbl Gynakol，2001，123（9）：520.

[4] 姜玉石，邹庆华.多西他赛对乳腺癌细胞中TP酶的调节及化疗敏感性研究[J].第四军医大学学报，2007，28（17）：1580.

[5] 方志娥，曲 斐，尚京川.固相萃取/高效液相色谱法对肝癌细胞中多西紫杉醇的测定[J].分析测试学报，2010，29（3）：276.

[6] 刘 磊，陈秀杰，朱文良，等.HPLC法测定肿瘤细胞中酒石酸长春瑞滨的浓度[J].药物分析杂志，2008，28（5）：807.

[7] 刘 韬，黄红兵，林子超，等.高效液相色谱法测定人血浆中多西紫杉醇浓度[J].中国医院药学杂志，2007，27（7）：897.

[8] 李 欣，刘 燕，康艳敏，等.高效液相色谱法测定多西紫杉醇静脉纳米乳剂的含量[J].解放军药学学报，2007，23（1）：32.

[9] Andersen A，Warren DJ，Brunsvig PF，et al.High sensitivity assays for docetaxel and paclitaxel in plasma usingsolid-phase extraction and high-performance liquid chromatography with UV detection[J].BMC Clinical Pharmacology，2006，13（6）：2.

[10] 杨 蓓，郑璐侠，段更利，等.高效液相色谱法测定多西紫杉醇注射液含量及其有关物质[J].复旦学报（医学版），2006，33（5）：701.

[11] 宁方玲，杨耀琴，陶惠红，等.泰索帝合并Tween-80对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响[J].同济大学学报（医学版），2005，26（2）：8.

Content Determination of Docetaxel in MCF-7Cell Extracellular and Intracellular Fluid by SPE-HPLC

KE Chang-yi，CHE Ke-ke
（Chongqing Third People’s Hospital，Chongqing 400014，China）
WANG Li-juan
（Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 400030，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of docetaxel（DOC）in extracellular and intracellular fluid of human breast cancer cell MCF-7.METHODS：HPLC method was adopted.The samples of extracellular and intracellular fluid were prepared and the protein was removed using trichloroacetic acid.The DOC was extracted by solid phase extraction column（SPE）.The samples were separated on a symmetry-C18column with mobile phase consisted of potassium phosphate buffer-acetonitrile（50∶50，V/V）.The column temperature was 30℃ and detection wavelength was set at 230nm.RESULTS：The linear range of DOC in extracellular and intracellular fluid was 0.05～5.50μg·mL－1（r＝0.9993，r＝0.9990）with average recovery more than 94%（n＝5）.The RSD of intra-day and inter-day were lower than 5%（n＝5）.The lowest detection limits were 0.05μg·mL－1and 0.03μg·mL－1.The content of DOC in intracellular fluid was much higher than in extracellular fluid.CONCLUSION：The method is simple，sensitive and with little interference，and could be applied for the content determination of DOC in extracellular and intracellular fluid of MCF-7cell.

Docetaxel；Human breast cancer cell MCF-7；Intracellular fluid；Extracellular fluid；SPE-HPLC；Content determination

R979.1

A

1001-0408（2011）17-1569-03

＊副主任药师。研究方向：医院药学、药事管理学。电话：023-63510273。E-mail：666666kecy@163.com

2010-12-06

2011-02-17）

·药房管理·