施万氏菌致病性的研究进展＊

汪永禄(综述),王多春,詹圣伟(审校)

施万氏菌(S hewanella)属有30多个种,由于多数为嗜冷菌而不为临床微生物学家所关注。施万氏菌可以广泛从环境中分离出来,嗜冷的有S.putref aciens,S.baltica,S.f rigidimarina,S.woodyi和S.dinitrif icans;嗜好寒的有S.gelidimarina和S.hanedai[1],亦有嗜温的,如:S hewanella algae(S.algae),S.amazonensis,S.colwelliana,S.oneidensis和S.putref aciens;1985年,MacDonell等根据5S rDNA序列数据分析,认为它是一个新属,建议命名为施万菌属(S hewanella),并将其归为弧菌科的一个新属[2]。施万菌属分布于环境中,常见于海水和淡水中。与临床有关的种只有海藻施万菌(S.algae)和腐败施万菌(S.putref aciens)[3],目前80%的临床分离菌是海藻施万菌,常见的海藻施万菌感染包括耳部和软组织的感染[4-5],比较严重的感染有菌血症、脑膜炎和心内膜炎[6]。目前由施万氏菌引起的人畜共患感染性疾病已引起世界各国微生物工作者的重视,对该菌的研究也取得了一定的进展,现综述如下。

1 生物学特性

1.1 形态特征 施万氏菌呈直杆状,大小为0.8～1.3μm×1.8～2.4μm。在陈旧培养物或不良培养条件下,通常可见到退化型。具有呼吸和发酵代谢类型。最适生长温度为18～25℃。常见分离于海洋环境和海生动物的消化道中;有的种发现可作为海鱼的特殊发光器官的共生体。在营养琼脂培养基上产生橙色色素,但不分泌到培养基中。腐败施万菌由于其DNA的 G+Cmol%含量的低值(38～50)而区别于假单胞菌属,Baumann等于1972年将其归至交替单胞菌属(A lteromonas)。在 1985年MacDonell和Colwell根据5S rRNA序列比较,另立新属——施万菌属(S hew anella)。DNA的 G+C含量为44～54 mol%。后来由于新种海藻施万菌的发现,使范围扩至52～54mol%。

1.2 培养和生化特性 本菌需氧或兼性厌氧,不发光。在无盐环境中不能生长,耐盐浓度可达10%,大部分菌株在8%NaCl的浓度下还可产生菌膜。在65℃环境中能存活10min。4℃不生长,氧化酶阳性,产过氧化氢酶,37℃培养24h后,不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、纤维二糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、山梨醇、甘露醇、亚硝酸盐还原、吲哚均为阴性,硝酸盐还原阳性,明胶水解阳性、DNA酶阳性、淀粉酶阴性,大部分菌株尿素阴性,不利用枸橼酸盐,精氨酸二水解酶、赖氨酸脱羧酶阴性,鸟氨酸脱羧酶阳性。该菌最适宜的p H为7.5。细菌在此p H值时菌体生长最快,菌量最大。与临床致病性有关的海藻施万菌(S.algae)和腐败施万菌(S.putref aciens)的主要生长和生化特征见表1。

2 致病性

一般认为它是引起水产高蛋白食品腐败变质的主要细菌类群,也有研究指出它是人和水生动物的机会致病菌。近年来,国内外先后报道了由施万菌引起的水生动物的疾病。2000年5月,我国的珠海、深圳、湛江等地网箱发生养殖红拟石首鱼流行性病害,病鱼出现体表不定部位的溃烂、腹腔积水、肠积水、肾毛细血管充血,严重时可导致死亡[7]。之后,Richards GP等[8]从海水和牡蛎分离到腐败施万菌,致病性施万菌和发光菌可能对通过摄入受污染的海产品而对健康造成威胁,例如在海洋环境中擦伤,或游泳及其他娱乐活动。目前,施万菌属中与临床有关的种只有海藻施万菌和腐败施万菌。常见的海藻施万菌感染包括耳部和软组织的感染,比较严重的感染有菌血症、脑膜炎和心内膜炎。1996年,Dominguez等首次报道了由海藻施万菌引起的菌血症和下肢溃疡的临床病例[9],之后陆续报道了海藻施万菌引起的血液透析败血症[10]、肝硬化病人感染海藻施万菌表现为急性坏死性筋膜炎,原发性海藻施万菌血症、海藻施万菌引起骨髓炎[11]、恶性肿瘤病人伴上消化道出血接受洗胃及胃镜检查感染施万菌以及海藻施万菌引起呈绿色心包渗出液的化脓性心包炎[12]。对于由施万菌引起的暴发性感染,韩国则曾发生了在医院的一个综合外科单元由于共用一个量杯引起的海藻施万菌和腐败施万菌感染,先后从31例患者的血液中分离到9株、胆汁中是8株、腹水中也是8株,从一个共同的量杯表面分离到一株施万菌,并经脉冲场凝胶电泳实验有12株为同一感染源[13]。说明施万菌已在医院出现,并成为潜在的人类病原体。汪永禄等人也从两起聚餐性食物中毒腹泻患者标本中分离到海藻施万菌和腐败施万菌,这是国内外第一次从食物中毒标本中分离到施万菌的报道[14]。

表1 腐败施万菌(S.putref aciens)和海藻施万菌(S.algae)的生长和生化特征

3 毒力和致病因子

Simidu等人在1990年首先从红藻中分离到海藻施万菌,并证实该菌为产河豚毒素(TTX)的细菌。1992年,Nozue等人发现腐败施万菌中一些 G+C含量高的株系(52%～54%)在遗传特性上与海藻施万菌一致,而且所有的海藻施万菌都有溶血现象,但是腐败施万菌缺乏相应的活性。因此,他们认为以前发现的腐败施万菌中有一些应该是海藻施万菌。根据这些新的标准,Nozue等对以前鉴定为腐败施万菌的40个临床株系进行了重新鉴定,发现有33个株系是海藻施万菌。1996年,Dominguez等首次报道了由海藻施万菌感染引起的菌血症和下肢溃疡的临床病例。1998年,Khashe等通过小鼠实验证实,海藻施万菌比腐败施万菌有更强的致病力,并由此认为海藻施万菌是施万菌属中最为重要的病原菌。推测海藻施万菌的溶血活性可能是重要的毒力因子。同时,菌膜形成也可能是耳部感染病例的原因。

汪永禄等对分离的海藻施万菌和腐败施万菌进行了溶血实验,结果表明海藻施万菌在血平板产生β-溶血现象,并形成粘液状菌落。而腐败施万菌则无溶血情况和粘液状菌落[14]。目前,已从各种各样的海洋动物中分离出产 TTX的细菌,并已经生物学和生化学的鉴定证明,这些细菌大多数为弧菌类成员。近年来,从越来越多的海生生物和海生菌中检测到 TTX,施万菌也属于产 TTX菌。但是,由于目前细菌产生 TTX的产量非常低,仅为ng级,而且 TTX产生的规律及影响因素尚为完全明了,其代谢机制仍处于基础研究阶段。因此,对于施万菌属产生TTX的原理还需进一步研究。

4 实验室检测

4.1 传统的分离鉴定 目前,由于对施万氏菌属的研究比较少,同时,因为该属的种间的生化特征几乎一样,传统对于其的检测分离很难鉴定。传统的分离方法中,增菌和选择性增菌是不可或省的步骤,施万氏菌属弧菌科,同时,该菌为嗜盐菌,其增菌的条件只要用按照弧菌科的增菌方法或者在7.5%的氯化钠肉汤中均可生长,然后分离TCBS琼脂、营养琼脂、B-P琼脂等培养基都可以生长。在 TCBS琼脂培养基上为中等大小、光滑、凸起、圆形、边缘无色、中间黑色。在B-P培养基上的生长特征为菌落1～2mm、凸起、无晕、灰黑色、园形、较丰满。在血平板上培养后,可产生明显的β-溶血,溶血直径为3mm。在 TSI斜面为底层黑色、产硫化氢、不产气、斜面产碱[14]。同时,做触酶和氧化酶实验,阳性后则可采用API法和细菌自动鉴定仪进行鉴定。但是,由于海藻施万菌和腐败施万菌的生化几乎相同,API法只能鉴定为腐败施万菌,而全自动微生物生物分析系统的自动化检测,虽然操作标准化、简便、快捷、准确率高,然而两者唯一区别仅为在菌膜、温度生长及溶血上的区别,海藻施万菌不形成生物膜、在4°C不能生长以及置42℃72h后产生明显的β-溶血现象,这些生物学特性上与典型的腐败施万菌相比不同[15]。因此,采用传统的和全自动微生物生物分析系统检测方法鉴定两种菌的区别结果则需要商榷。

4.2 分子生物学检测 1985年,MacDonell等首先采用5S rDNA序列数据对施万菌进行检测。目前,聚合酶链反应技术(PCR)的发展已经相当成熟,16S rDNA基因分子结构上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息,使其成为了一个较为理想的基因分类靶序列。对其序列进行分析,已被证明在细菌分类鉴定上具有重要价值。因此,可应用于施万菌属的种的鉴别。如Richards GP等在测试的276份水和贝类样本中,通过使用API 20E生化鉴定,挑选和鉴定到 421株细菌,其中 170(12.0%)为腐败施万菌,26(1.8%)鉴定为damselae亚种。665(46.8%)不能在API 20E生化数据库中找到。22株腐败施万菌经16S rRNA测序后,鉴定为施万菌属中的S.abalonesis,S.algae,S.baltica,S.haf niensis,S.marisf lavi,S.putref aciens,L istonellaanguillarum和P.damselae.[9]。同时,Botelho-Nevers等也采用 16S rRNA基因系列分析法对经施万菌腐烂表型实验误诊鉴定为海藻施万菌[11]。另外,汪永禄等对食物中毒中分离的8株施万菌采用16S rRNA进化树分析结果,其中7株施万属菌鉴定为海藻施万菌,1株鉴定为腐败施万菌。16R rDNA序列数据表明,7株产生β-溶血的分离菌株分离菌株与 GenBank库中的海藻施万菌(S.algaATCC51192)聚为一群,一株不产生-溶血的与 GenBank库中的腐败施万菌(S.putref aciensA TCC8071)聚为一群,从而进一步证实了结果的可靠性[14]。

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