猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析*

江 楠,席晓兰,王 杰,戴佳琳,廖兴江,黄 江

2.贵阳医学院化学教研室,贵阳 550004;

3.贵阳医学院法医学教研室,贵阳 550004

猪带绦虫是常见的人兽共患寄生虫,在我国病区多呈片状分布,其成虫寄生于人体小肠引起绦虫病,幼虫(囊尾蚴)寄生于人体皮下肌肉、脑、眼等处引起囊虫病[1-2]。近年来,本课题组先后构建了3种常见的人体带绦虫成虫cDNA质粒文库,并获得猪带绦虫1 171条UniGene,这些基因涉及到虫体的结构、代谢、运动、物质转运等多方面,我们期望通过进一步研究,筛选出具有应用价值的免疫诊断抗原或疫苗候选分子[3-4]。苹果酸脱氢酶(MDH)是三羧酸循环酶系中的重要组成部分,同时也与天冬氨酸转氨酶一起组成天冬氨酸-苹果酸穿梭体,参与细胞内物质间的转移,起到在胞浆和线粒体之间转运苹果酸和还原性平衡物的作用,另外在糖异生和糖酵解等方面也起着重要的作用[5-7]。因此,MDH适宜于筛选特异的抗寄生虫药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清、文库、质粒和菌株 猪带绦虫虫体标本采自四川甘孜雅江,亚洲牛带绦虫病人、猪带绦虫病人及牛带绦虫病人血清取自粪检阳性的带绦虫病人。猪带绦虫成虫全长 cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene分析由北京华大基因有限公司合作完成。大肠埃希菌BL21/DE3及原核表达质粒pET-28a(+)由中山大学热带病重点实验室惠赠。

1.1.2 主要试剂和工具酶 NdeⅠ、HindⅢ、Ex TaqTM酶 、dNTP、RNaseA 、T4 DNA 连接酶、分子量标准:DNA marker DL2000、DL15000均购自大连宝生物工程有限公司,DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA快速提取试剂盒购自赛百盛技术有限公司(中国北京),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司(美国),Ni-NTA Agarose(Cat.No.30210)购自德国NOVEGN公司,丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)购自上海伸友生物科技有限公司,低分子量蛋白分子量标准购自Fermentas公司(立陶宛),预染蛋白质分子标准购自 TaKaRa公司(日本),硝酸纤维素滤膜(PVDF)膜购自Millipore公司(美国),大鼠抗HIS标签抗体购自鼎国生物技术有限公司(中国北京),辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗大鼠、抗人IgG(H+L)抗体、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自Boster公司(中国武汉)。

1.1.3 引物的合成和DNA的测序 基因扩增引物由Introvigen上海生物技术有限公司合成,重组质粒DNA的测序由英俊科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 猪带绦虫苹果酸脱氢酶(Ts MDH)基因的识别 本实验组已经成功构建了猪带绦虫成虫cDNA质粒文库[8]。将获得的猪带绦虫unigene进行Blastx分析,获得编码猪带绦虫MDH基因的质粒,GenBank登陆号为GT227115,并通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://ca.expasy.org/)预测其理化性质。

1.2.2 Ts MDH基因的PCR扩增 根据已获得的MDH编码序列,利用 DNAClub和PCRdesign设 计 引 物 。 P1:5′-GGACATATGATGCCTGGACCTCTTAGGGTT-3′,带 NdeⅠ酶切位点 ,P2:5′-GCGAAGCT TTCACT TGAAGGAGGAAAGA GC-3′,带 HindⅢ酶切位点。

以猪带绦虫成虫cDNA文库MDH的质粒为模版,进行 PCR扩增,反应条件为:94℃5 min;94℃30 s;94℃1min,61℃1min,72 ℃1min,共35个循环;72℃10 min。PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳回收

1.2.3 重组原核表达质粒的构建及鉴定 将PCR产物和原核表达质粒 pET-28a(+)用 NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切后回收,连接、转化入大肠埃希菌BL21/DE3感受态细胞,卡那霉素筛选阳性单克隆,对该阳性克隆提取质粒进行PCR,双酶切和测序鉴定。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达 取50μ L培养过夜的阳性克隆菌液,加入到含有卡那霉素的5mL LB培养基中,37℃250 r/min振摇至吸光度(A600值)=0.4-0.6时,加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达5h(并做相应阴性对照)。离心收集菌体,在沉淀中加入100μ L 1×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液,煮沸5-10min,13 000r/min 离心 1min,取上清 10μ L,进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.5 重组质粒的大量诱导和纯化 按上述方法对阳性克隆进行大量的诱导表达,离心收集菌体,冰上超声裂解,分别取上清和沉淀样品处理后行SDSPAGE判断该重组蛋白的可溶性。并收集上清,用0.45μ L滤膜过滤,参照镍离子金属螯合剂亲和层析柱说明书进行蛋白纯化,收集蛋白洗脱液,再将洗脱的目的蛋白在PBS透析液(pH=7.4)中4℃透析24h(期间换透析液 2-3次),并根据说明书,用Bradford[9]法对经过以上步骤获得的重组蛋白进行蛋白定量,于-80℃保存备用。

1.2.6 重组蛋白的蛋白质印迹(Western blotting)分析 将纯化的蛋白进行SDS-PAGE(12%)电泳,将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上,BSA室温封闭2h,再分别与亚带、牛带、猪带绦虫病人、感染猪带绦虫的猪血清、正常人血清、SD大鼠免疫血清及SD大鼠正常血清(按1∶200稀释)孵育,4℃过夜;次日,PBS洗3次,每次5min,然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪、羊抗鼠、兔抗人IgG(按1∶2 000稀释)室温孵育 1h,PBS洗3次,每次5min;二氨基联苯胺(DAB)显色至出现目的条带,超纯水终止反应。

2 结 果

2.1 MDH基因的识别和生物信息学分析 在已获得的cDNA文库Unigene中,经Blastx分析该基因全长1 343bp,编码区为 1 78bp～1 173bp,编码332个氨基酸,理论分子量是36459.2kDa,等电点是8.39。

2.2 原核重组载体的鉴定 将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,见图1。结果显示在1000bp左右有一清晰条带,与目的基因预测大小基本相符,此外重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致,证明重组质粒构建成功。

图1 重组质粒的双酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant by digestion with NdeⅠand HindⅢ

2.2 蛋白纯化结果 将构建好的重组质粒转化到E.coli BL21/DE3中表达,SDS-PAGE电泳分析结果如图2中显示,大约在41kDa左右处出现目的条带,与理论分子量基本相符。将蛋白进行纯化,结果如图中第7泳道所示,其位置与目的蛋白相符,证明目的蛋白纯化成功。测得纯化产物的蛋白浓度为0.32mg/mL。

图2 重组质粒pET-28a(+)-MDH在大肠杆菌BL21/DE3的原核表达及其纯化产物SDS-PAGE电泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product of pET-28a(+)-MDH

2.3 重组蛋白免疫原性鉴定 用纯化蛋白免疫SD大鼠8周后的血清及正常大鼠血清与纯化蛋白进行Western Blotting,结果见图3,结果显示重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,而不能被正常大鼠血清所识别。

图3 Ts MDH重组蛋白免疫原性的Western blotting分析Fig.3 Western blot analysis of Ts MDH

2.4 重组蛋白免疫反应性鉴定 用感染猪带绦虫、亚洲带绦虫、牛带绦虫的患者血清及猪带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白进行 Western Blotting,结果均显示出较清晰条带,见图4中第1、2、3、4泳道,而阴性对照血清即健康人血清,未出现蛋白条带,见图4中第5泳道。

图4 Ts MDH重组蛋白免疫反应性的Western blotting分析Fig.4 Western blot analysis of Ts MDH

3 讨 论

猪带绦虫在全世界分布很广,在我国分布也很普遍。分子生物学技术的不断发展,利用基因工程疫苗进行绦虫病的诊断及预防已是备受关注的研究方向,而多种组合疫苗的联合免疫,也是今后研制绦虫疫苗的一个主要方向。要达到这个目的,筛选并克隆较多有用的基因就成为现阶段本课题组的研究重点。苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)普遍存在于动物、植物和细菌中等各种生物中,根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布和生理功能的不同,MDH在不同生物中可分为不同的类型,即依赖于氧化型辅酶Ⅰ(NAD)的MDH和依赖于氧化型辅酶Ⅱ(NADP)的 MDH;位于胞浆的MDH和位于线粒体的MDH[10]。作为三羧酸循环酶系中的重要组成部分,催化了草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换,同时也与天冬氨酸转氨酶一起组成天冬氨酸-苹果酸穿梭体,参与细胞内物质间的转移,起到在胞浆和线粒体之间转运苹果酸和还原性平衡物的作用;在糖异生和糖酵解等方面也起着重要的作用,是细胞中不可缺少的酶。

本次实验,我们通过生物信息学的相关软件进行分析,预测重组蛋白理论分子量是41kDa,图2的4、5、6、7泳道显示的重组蛋白与预期的大小一致,且条带较浓,表明重组蛋白获得高效表达,同时纯化的重组蛋白浓度达到0.32mg/mL,足以进行各种酶学实验,可为该蛋白下一步研究奠定基础。由于抗生物学物质的抗体容易制取,并具有高度特异性,因此抗体成为许多分析和制备生化方法的核心。Western-blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的方法,可用于不同抗原的比较和定量,能检测样品中的微量成分和近似相对分子质量。既可以定性,又可以半定量[11-13]。图3结果显示重组蛋白可被重组蛋白免疫大鼠血清所识别,说明重组蛋白能够刺激大鼠免疫系统产生相应抗体,具有免疫原性;图4中重组蛋白能被猪带绦虫病人血清所识别,表明重组蛋白能够与患者血清中的特异抗体反应,说明该重组蛋白具有免疫反应性;但因其还可与其他两种带绦虫感染血清发生反应,证明其诊+断特异性不高,推测不能作为诊断候选分子,但其具有免疫活性的高效表达,也可推测Ts MDH是一个具有开发潜力的基因,而本实验也为此基因重组蛋白的进一步研究,特别是免疫学方面的功能等各方面的研究奠定了基础。

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