施万细胞培养与纯化研究进展

李 陈(综述)，肖玉周(审校)

(蚌埠医学院第一附属医院骨科，安徽 蚌埠 233000)

施万细胞是周围神经所特有的一种胶质细胞，主要功能是对轴突提供支持与保护、形成髓鞘，并且能分泌多种活性物质(如神经营养因子、细胞外基质及黏附因子等)，这些活性物质对维持神经纤维的存活、生长以及损伤后的再生具有重要的生物学作用[1]。目前，以移植施万细胞治疗神经损伤及诱导神经鞘再生的组织工程学成为研究的热点[2]。在周围神经的轴突损伤后，施万细胞从损伤神经远侧端清除轴突和髓鞘崩解物，同时施万细胞可分泌促神经再生的各类因子，为轴突营造适宜的再生环境[3]。因此，施万细胞是组织工程中种子细胞的最佳选择。但在组织工程实施过程中，高纯度的施万细胞需求往往很大，因此其体外培养、纯化、扩增显得至关重要。

1 施万细胞的来源与取材

1.1细胞来源 施万细胞的传统来源主要是从鼠、兔、猴等哺乳动物的胚胎或新生动物取材，但动物来源的施万细胞作为种子细胞在临床应用时却受到相对的受限，近年来研究的重点放在人来源的施万细胞上，能够更有效的减少免疫排异反应。研究发现，直接从新鲜的周围神经取材进行施万细胞的培养产量较低，很难达到实际的需求[4-5]。大多数的研究人员采用预变性的周围神经作为取材对象，施万细胞在成年动物周围神经被切断后的Waller变性的早期大量增殖，许多学者通过对成年动物周围神经进行预变性来获得更多数量的施万细胞，因为神经损伤后巨噬细胞能够分泌生长因子，能促进施万细胞分裂[6]。

1.2取材 施万细胞的主要取材部位有：正中神经、坐骨神经等混合神经以及背根神经节等，且实验表明运动与感觉神经来源的施万细胞分泌的神经营养因子不同，至于何种来源的施万细胞治疗效果明显，还有待探索[7]。取材过程中关键在于去除参杂的成纤维细胞，由于其主要存在于神经外膜和神经束膜中，应尽可能去除这些成分。

2 施万细胞培养方法

2.1植块法 植块法原理是成纤维细胞的增殖速度要比施万细胞快，通过反复的贴壁便可以获得较高纯度的施万细胞。此方法培养的周期较长，且培养过程中伴随着细胞活性及分裂能力的下降。有人在此基础上做出了改进，采用直接植块法和反复植块法，即将施万细胞种植于鼠尾胶包埋的共聚物支架上，减少了反复消化离心和差速贴壁造成的对细胞生长周期的影响，从而使培养的施万细胞保持稳定的生物学功能[8]。在此基础上反复多次，就是反复植块法。

2.2酶消化法 酶消化法的主要原理是用酶去除组织中的间质，使组织更为分散而使细胞呈单层排列。Qin等[9]将植块反复种植法和酶消化法联合使用，用0.25%Ⅴ型胶原酶和0.03%胰蛋白酶消化出生3 d 的SD大鼠鼠臂层神经和坐骨神经组织块40 min，再将组织块贴壁培养。采用组织块反复种植纯化法、低浓度胰酶快速消化和差速贴壁法对施万细胞进行纯化，结果施万细胞活性较高，纯度可达90%以上，细胞所受到的外界因素影响也较少。

2.3三维培养法 植块法、酶消化法主要是基于二维培养方法，然而体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维化单层细胞培养，三维细胞培养技术是将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞外基质蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，所创建的细胞生长环境则最大程度地模拟体内环境[10]。在施万细胞的培养中也有学者采用该方法进行培养，在培养液中放入三维支架，使细胞贴壁，形成Bungner带，支架的主要材料是胶原，其次还有聚酯纤维、聚乳酸等[11]。Moradi等[12]采用三维自组装多肽水凝胶作为基质三维培养人胎儿施万细胞，结果培养出的施万细胞活性较高，细胞形态更加典型，且0.25%水凝胶效果最佳，能够形成良好的形成纳米纤维支架结构。

3 施万细胞纯化方法

植块法和酶消化法是施万细胞培养的最经典的两种方法，虽然其操作简便，但是所获得的细胞中容易混有杂质细胞(主要是成纤维细胞)。为此，人们在这两种方法的基础上不断改进，有了一系列除去成纤维细胞的提纯方法。

3.1抗有丝分裂法 抗有丝分裂剂有阿糖胞苷等，能够对S期细胞产生特异性杀伤，并且能抑制DNA多聚酶，干扰DNA的合成与复制。Wei等[13]采用阿糖胞苷处理细胞24 h，然后将培养基更换为含0.02 μg/L外源性生长因子处理48 h，最后采用差速贴壁法，经过10 d的原代培养，进行传代，最终第5代施万细胞的纯度可达到99%。也有报道显示，这些抗有丝分裂剂缺乏特异性，会对施万细胞产生一定的毒性，会阻断神经生长因子转导，影响神经的再生，因此不适合在临床上推广[14]。

3.2免疫选择纯化法 胸腺嘧啶1(thymine-1，Thy-1)抗原特异性表达于成纤维细胞，通过反复使用Thy-1抗体，结合补体介导的细胞裂解利用，能够培养出高纯度的施万细胞[4-5]。Nash等[15]通过向培养液中加入抗Thy-1抗原，37 ℃孵育30 min，然后转到含免疫球蛋白G的培养基上，成纤维细胞黏附到培养基上，最后将施万细胞重新吸出，原代培养10 d，纯度可达90%，第5代纯度高达99%；细胞密度为2×107L-1。然而，该方法存在着培养效率低、费时费力、价格昂贵等劣势，很难在临床上推广。

3.3免疫磁珠法 免疫磁珠是一项新的免疫学技术，它运用核-壳的合成方法合成含有四氧化三铁超顺磁性的高分子表面覆盖高分子，其稳定性好，能进行后期标记，利用这些物质表面的功能基团(如氨基、羧基、巯基等)进行抗体的共价或者非共价偶联，可用于结合施万细胞表面特有的标记抗原p75抗原，这样在外加磁场的吸引下可作定向移动，从而达到分离提纯施万细胞的目的。Vroemen等[16]应用该方法，经过9 d的原代培养后分离出了纯度为95%的施万细胞，细胞密度为1×107L-1。黄明等[17]在免疫磁珠法基础上加以改进，采用双酶2次法培养施万细胞，7 d后应用免疫磁珠法对细胞进行纯化培养，纯化后施万细胞纯度为98.0%，培养2 d后就可以传代。使用具有抗Thy-1标记的磁珠，除去成纤维细胞已有报道[18]。然而，这种方法也面临着费时、价格昂贵等的特点。

3.4神经刺激因子纯化法 在正常施万细胞培养的过程中加入刺激因子，如牛垂体抽提物(bovine pituitary extract，BPE)，BPE含有多种生长因子(如内源性碱性成纤维细胞生长因子1神经生长因子等)，这些生长因子也具有激活腺苷环化酶的活性，它们可以通透细胞，激活腺苷酸环化酶，从而升高细胞内的环腺苷酸水平，能够促进施万细胞的有丝分裂，促进施万细胞增殖的作用。赵勇等[19]将成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经剪碎至1 mm3的植块，反复差速贴附法进行培养，同时用内源性碱性成纤维细胞生长因子、forskolin刺激增殖，结果可获得施万细胞的纯度达94%以上。由于这些刺激因子的特异性不强，在促进施万细胞有丝分裂的同时也会促进成纤维细胞的生长。

3.5条件培养基纯化法D-氨基酸氧化酶基因在施万细胞的水平显著高于成纤维细胞，其能够分解利用D-缬氨酸[20]。因此，利用此原理能够达到纯化施万细胞的目的。Kaewkhaw等[21]采用预变性7D的大鼠坐骨神经，然后去除外膜，游离组织酶，然后在改良杜氏伊格尔培养液(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)-D-缬氨酸中培养，DMEM培养液中加入促有丝分裂因子，包括Forskolin、胎牛血清和BPE，结果：原代施万细胞纯度为97.3%，第2代纯度达98.3%，经过培养19 d后细胞密度为1.2×108L-1。该方法特点为产量高、纯度高、细胞活性高、培养操作简便等，但培养周期较长。

3.6层粘连蛋白纯化法 由于施万细胞在生长过程中会黏附在基膜上，而层粘连蛋白是基膜的主要成分，施万细胞对于层粘连蛋白有着很强的亲和力，因此将层粘连蛋白包被在培养基的底物上，然后将分离的施万细胞添加到培养基中，施万细胞将会先于成纤维细胞结合到培养基中，这样经历几个循环，就可以获得纯度较高的施万细胞。Pannunzio等[22]应用该方法，经过5代培养，得到的施万细胞纯度可达90%左右。该方法纯化细胞的周期较短，但纯度相对较低。

3.7非特异性的纯化方法 非特异性的纯化方法很常见，如冷喷射法，该方法是利用在较冷环境中不同细胞贴壁能力的不同，采用预冷的磷酸缓冲液冲击贴壁细胞，使某种细胞先脱落，而达到纯化细胞的目的。研究表明，施万细胞较成纤维细胞黏附性弱，将首先被冲下来，将其搜集起来继续培养，从而达到纯化施万细胞的目的[23]。该方法由Jirsová等[24]首先报道，选取15 d龄大鼠，分离背根神经节，采用酶消化法处理组织，待细胞长满后以冷喷射法提纯施万细胞，一次纯化细胞纯度可达到95%，并可在之后的纯化中使施万细胞纯度达到99%以上。Mauritz等[25]也采用该方法并采用预变性的大鼠坐骨神经，培养基中加入BPE、forskolin、成纤维生长因子2，采用冷喷射法去除成纤维细胞，经过21 d的原代培养，融合度达到80%传代，第2代纯度达69%，第3代达94%，且细胞密度较高，达1.2×108L-1。该方法有操作方便，不必使用细胞毒性化学试剂，且纯化效果好等优点。冷喷射法的不足：最主要的是该方法对温度要求较高，高的环境温度会使4 ℃的冷喷射液快速升温，使施万细胞难以被喷射液吹落；而加大喷射力度势必造成成纤维细胞的脱落，难以达到纯化的目的。李爽等[26]在经典冷喷射法的基础上对其进行改良，对施万细胞采用冰浴处理，使培养液快速降低到接近冰水混合物的温度，克服了温度对实验效果造成的影响。

4 小 结

近年来随着医学的长足发展，用组织工程学的方法来修复损伤神经成为一种趋势，施万细胞作为周围神经所特有的胶质细胞，其在周围神经发育与再生过程中的特殊作用，使其成为组织工程中重要的种子细胞，越发引起学者们的重视。高纯度、高活性的施万细胞成为组织工程技术在临床成功应用的保证，现如今人们对其培养与纯化技术已经有了一定程度的探索，但是目前还存在着如纯度低、周期长、活性弱等方面的不足，希望在不远的将来能够攻破这些难关，更好地造福于人类。

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