密码子优化提高重组金葡菌肠毒素O在大肠杆菌中的表达水平

黄 鹏，孙红颖，陈枢青

密码子优化提高重组金葡菌肠毒素O在大肠杆菌中的表达水平

黄 鹏，孙红颖，陈枢青

(浙江大学药学院药物毒理与生化药学研究所，浙江杭州310058)

目的：优化稀有密码子提高重组肠毒素O的表达量。方法：将带His标签的肠毒素O成熟肽克隆至pET28a质粒上，采用PCR方法对15个稀有密码子进行突变，将突变后的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，并进行蛋白表达及活性鉴定。结果：通过稀有密码子优化，重组肠毒素O的表达量由菌液总蛋白的7.49%提高至19.8%;小鼠淋巴细胞增殖试验表明，通过密码子优化的肠毒素O具有刺激淋巴细胞增殖的作用，并且其增殖作用与未优化前的肠毒素O相当。结论：稀有密码子优化能够有效增加肠毒素O的表达量。

葡萄球菌，金黄色/免疫学;肠毒素类/免疫学;密码子;基因表达;遗传载体;质粒;突变;细胞增殖;淋巴细胞

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(3):297-303.］

金葡菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)是由金黄色葡萄球菌分泌的一类蛋白质［1］，可以不经抗原提呈细胞(APC)加工处理，以完整分子的形式与Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)和 T细胞受体(TCR)结合成复合物，从而刺激T细胞的活化、增殖，并且大量释放细胞因子［2］。目前被成功鉴别并分离的主要肠毒素血清型有20多种:TSST-1、TSST-2、SEA ～SEE、SEG ～SEQ［3］及 SEU2 和 SEV［4］等。这些肠毒素都由一系列遗传元件携带，具有高度相似的三维结构和稳定性［5］。肠毒素 O(SEO)属于新型肠毒素或类肠毒素，其基因由egc携带，与同家族成员的氨基酸序列同源性介于23.7% ～43.2%［6］。本实验室已成功克隆表达了重组金葡菌肠毒素O(rSEO)，并证实其具有超抗原活性［7］，但其表达量和凝血酶酶切活性较低，使得rSEO得率较低。有研究报道［8］，外源基因所含稀有密码子的丰度影响着大肠杆菌对其的表达，对肠毒素A进行密码子优化能使其表达量上升至总蛋白的15%～20%［9］。为此，本研究通过 Quick Change点突变法对肠毒素O包含的15个稀有密码子进行优化，最后经过pET表达系统进行蛋白表达，以及生物学活性鉴定，为今后的肠毒素相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒细胞系 E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)为本实验室保存;pGEX-4T-1、pET28a和pGEX-4T-1-SEO质粒也为本实验室保存;ICR小鼠，体重(15±2)g，雄性，购自浙江大学实验动物中心。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR聚合酶、限制性内切酶XhoI、EcoRI和T4连接酶为Takara产品;Ni2+NTA His-bind resin层析凝胶购于Novagen;亲和层析相关的缓冲液Bind Buffer(50 mol/L 磷酸钠，10 mmol/L 咪唑，pH8.0)、Wash Buffer(50 mol/L磷酸钠，30 mmol/L咪唑，pH8.0)和 Elute Buffer(50 mol/L磷酸钠，150 mmol/L 咪唑，pH8.0)自配;脱盐柱(HiTrap Desalting)、阴离子层析柱(HiTrap Q Sepharose)为GE Healthcare产品;琼脂糖、琼脂和IPTG为BBI产品;蛋白胨、酵母提取物为OXIOD产品;胰蛋白酶、刀豆蛋白(ConA)为 Sigma产品;Western blot对照品HSA-PTH、SEC2-His为实验室制备;rSEO为实验室制备，切除GST-SEO融合蛋白的GST标签后获得;RPMI1640培养基为GIBCO产品;新生牛血清(FCS)为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;MTT为Sigma产品;DNA抽提试剂盒、DNA回收试剂盒为Amxygen产品;PCR引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成;DNA测序由上海桑尼基因集团有限公司完成。1.3 实验方法

1.3.1 SEO基因获得与表达载体pET28a-SEOHis的构建 以实验室贮存的PGEX-4T-1-SEO质粒为模板，设计PCR引物:上游gcagaattcat gaatgaagaagatc，下 游 actctcgagttagtggtggtggtggt ggtgtgtaaataaataaacatc;PCR获得带有 XhoI和EcoRI酶切位点，以及C端带有His-tag的重组肠毒素O，标记为 SEO-His。PCR条件为:5×PrimeStar Buffer 10 μl、dNTP(10 mmol/L)4 μl、上下游引物(10 μmol/L)1 μl、质粒模板 0.5 μl、PrimeStar 1U 补充 ddH2O 至 50 μl;98℃ 3 min，98℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s共25 次循环，最后72℃ 10 min。

XhoI、EcoRI双 酶 切 SEO-His片 段 和pET28a质粒，回收含黏性末端的SEO-His片段和pET28a片段，经T4连接酶连接后筛选阳性克隆。

1.3.2 稀有密码子分析与优化 通过http://www.doe-mbi.ucla.edu/～ sumchan/c altor.html和Genscript Rare Codon Analysis Tool在线分析软件分析SEO序列:SEO基因包含编码精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸的15个丰度较低的稀有密码子，密码子适应指数为0.68，平均 GC 含量为26.69%。

通过Quick Change法进行点突变，设计10条突变引物涵盖以上15个稀有密码子，其中1条涵盖3个稀有密码子的引物，3条涵盖2个稀有密码子的引物，6条涵盖1个稀有密码子的引物(表1)。以pET28a-SEO-His为原始模板，PCR获得产物经过DpnI消化后转化DH5α感受态并通过Kan抗性筛选阳性克隆，以测序正确质粒为模板和对应的引物依次进行剩余的PCR，突变后质粒依次编号为#1～#10。PCR体系条件分别为:5×PrimeStar Buffer 10μl、dNTP(10 mmol/L)4 μl、上下游引物(10 μmol/L)1μl、质粒模板0.5 μl、PrimeStar 1U 补充 ddH2O至50 μl;98℃ 3 min，98℃ 30 s、(50 ±5)℃ 30 s、72℃ 405 s共20次循环，最后72℃ 10 min。

表1 突变引物设计Table 1 The design of PCR primer for mutation

1.3.3 表达宿主的构建与表达条件优化XhoI和EcoRI双酶切pET28a-SEO-His的10个突变体，得到10个SEO-His片段，并与pET28a质粒重新连接，转化DH5α感受态扩增质粒。将扩增后的重组质粒转化，筛选阳性克隆落进行表达，优化表达条件为:1%接种量接种于2×YT培养基，37℃培养至OD值0.5左右，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，20℃诱导20 h。分别取突变株诱导后菌液进行SDS-PAGE分析。

1.3.4 SEO-His的纯化与鉴定 菌液离心、诱导，收集菌体 1 L，经 4℃、6 000 r/min 30 min，用30 ml Bind Buffer重悬，French Press 1 000 PSI高压破菌。8 000 r/min离心1 h，除去细胞碎片，上清经0.22μm微孔滤膜过滤，通过Ni2+NTA His-bind resin进行亲和层析，用100 ml Wash Buffer清洗，30 ml Elute Buffer洗脱;洗脱产物经HiTrap Desalting脱去盐离子后进行阴离子层析(HiTrap Q sepharose)，梯度洗脱除去20 kD左右的杂蛋白;脱盐后蛋白溶液通过50 kD半透膜去除70 kD左右的杂蛋白。

以SEC2-His为阳性对照，HSA-PTH为阴性对照，与SEO-His同时进行SDS-PAGE;转膜条件为100 V 2 h。一抗为抗His-tag的小鼠单抗，稀释比为1∶5 000;二抗为HRP标记山羊抗小鼠IgG，稀释比为1∶5 000。按以上条件对SEO-His进行Western blot鉴定。

1.3.5 MTT法测定SEO对小鼠淋巴细胞的增殖作用［7，10］以 ConA 为阳性对照，BSA 为阴性对照，测定重组肠毒素O刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖活性。分别取 rSEO、ConA、BSA和SEO-His，适量用 PBS溶解，0.22 μm 滤膜过滤、除菌备用。

设零孔(仅含培养基)、空白孔(脾淋巴细胞)、阴性对照孔(脾淋巴细胞+BSA)、阳性对照孔(脾淋巴细胞+ConA)和实验孔(脾淋巴细胞+重组肠毒素O)，每组3个复孔。将新鲜制备的ICR小鼠的脾淋巴细胞悬浮于含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，计数后将细胞浓度调节至2×106个/ml，每孔100 μl。分别将rSEO、SEO-His用无血清RPMI 1640培养基依次稀释至 20 μg/ml、2 μg/ml、200 ng/ml和 20 ng/ml，根据实验设计每孔加入100μl。重组肠毒素加入培养体系中，终质量浓度分别为10 μg/ml、1 μg/ml、100 ng/ml和 10 ng/ml。ConA和BSA经稀释后终质量浓度亦为10μg/ml、1 μg/ml、100 ng/ml和 10 ng/ml，在 37℃、饱和湿度5%CO2培养箱培养44 h后，每孔加MTT液(5 mg/ml)20μl，吹打混匀，在培养箱中继续培养4 h。弃培养液，每孔加DMSO 120μl，吹打助溶，37℃孵育10 min，待甲瓒完全溶解。然后，采用酶标仪双波长法(570 nm为测定波长，630 nm为参考波长)测定各孔OD值，检测重组肠毒素O对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。各孔OD值除以阴性对照为淋巴细胞增殖指数(proliferation index)。

1.3.6 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示。多组样本之间比较采用双因素方差分析(Two-way analysis of variance，ANOVA)，采用LSD法进行多重比较。所有数据均采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SEO-His基因片段的克隆重组表达载体的构建 以PGEX-4T-1-SEO为模板进行PCR扩增，获得的目的条带大小为700 bp左右，符合预期实验结果。

XhoI/EcoRI双酶切处理SEO-His基因片段和pET28a质粒，通过胶回收试剂盒回收并纯化含有黏性末端的上述片段，T4连接酶连接过夜后转化DH5α感受态，扩增获得的质粒经双酶切验证。阳性克隆测序结果显示插入基因与C端带His-tag的肠毒素O成熟肽完全一致。

2.2 PCR方法进行定点突变 按照 Quick Change点突变法进行稀有密码子优化，PCR扩增所得大小为6 000左右的目的片段，转化扩增后获得的质粒经XhoI/EcoRI双酶切验证并测序。

图1 SEO-His与其突变株的诱导表达Fig.1 Soluble expression of SEO-His and its mutants

2.3 SEO-His的表达与各个突变株的表达比较 按上述条件诱导表达SEO-His，取菌液进行SDS-PAGE分析，显示在29 kD处有明显条带;在相同条件下诱导表达各个突变种，通过菌液SDS-PAGE分析，比较密码子优化过程中各个点的表达情况(图1A、B);通过灰度扫描，计算出各个突变种所表达的目的蛋白占菌体总蛋白比。结果显示，未突变菌株以及突变菌株#1～#10的SEO-His表达水平(占菌体总蛋白百分比，%) 分别为:7.49 ± 0.30、10.4 ± 0.71、14.7 ± 0.68、15.6 ± 0.51、15.6 ± 0.95、16.6 ±0.81、17.2 ±0.74、17.5 ±1.0、17.7 ±1.1、19.7±0.55、19.8 ±0.63。

2.4 SEO-His的纯化 将高压超声破菌处理后的菌液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液经Ni2+NTA His-bind resin进行亲和层析，Elute Buffer洗脱下的溶液进行SDS-PAGE分析(图2A)。将脱盐后产物进行阴离子层析除去20 kD杂蛋白，再次脱盐后通过50 kD半透膜除去70 kD杂蛋白后进行SDS-PAGE分析(图2B)。电泳结果显示获得的SEO-His有较高纯度，可进行后续实验。

2.5 Western blot鉴定 以 His-tag为靶标进行Western blot，SDS-PAGE对照和 PVDF膜显色结果显示:阳性(SEC2-His)和样品(SEOHis)均有明显条带，而阴性(HSA-PTH)并没有产生相应的反应(图3)。

图2 Ni2+NTA His-bind resin亲和层析(A)及纯化后的SEO-His(B)Fig.2 SEO-His purified by Ni2+NTA His-bind resin(A)and purified SEO-His(B)

图3 SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鉴定SEO-HisFig.3 Verification of SEO-His by SDS-PAGE(A)and Western blot(B)

2.6 MTT法测定重组肠毒素O对小鼠淋巴细胞的增殖作用 利用MTT法对重组肠毒素O与密码子优化后表达获得的SEO-His的超抗原活性进行了测试。对结果采用双因素分析法，显示与阴性对照相比，在0.01μg/ml～10μg/ml质量浓度范围内，密码子优化后的重组肠毒素O具有刺激小鼠淋巴细胞增殖作用(F=58.0、P ＜0.05，图4)。在 0.01 μg/ml下，与相同质量浓度阴性对照组(0.01μg/ml BSA 1.0±0.06)相比，rSEO、ConA、SEO-His组作用 48 h后，小鼠淋巴细胞增加概率有显著性的统计学意义(rSEO 组 1.2 ± 0.06，P=0.001;ConA组 1.1 ± 0.02，P=0.027;SEO-His 组 1.3 ±0.06，P ＜ 0.001);其他浓度的 rSEO、SEO-His及ConA作用48 h后，相比相同浓度下的阴性对照组，小鼠淋巴细胞增加概率均有统计学意义(10 μg/ml条件下，BSA 组1.0 ±0.09、ConA组 1.7 ± 0.05、rSEO 组 2.1 ±0.09、SEO-His组2.1 ±0.05，均 P ＜0.001)。而在 0.01、0.1、1、10μg/ml这4个质量浓度下，对rSEO及SEOHis两组数据进行分析，两药物对小鼠淋巴细胞的增殖作用并无统计学意义(P=0.13)。

图4 MTT法测定重组肠毒素O对小鼠淋巴细胞的增殖作用Fig.4 Stimulation effect of the recombinant staphylococcal enterotoxin O on proliferation of murine lymphocytes by MTT assay

3 讨论

目前研究表明，在大肠杆菌中编码精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸及脯氨酸的一些稀有密码子，如 AGG/AGA/ATA/CTA/GGA/GGG/ACG/CCC等对蛋白质表达水平影响较大［11-13］，而对SEO的密码子分析表明，其核酸序列中包含大部分上述稀有密码子。本研究通过定点突变技术，用10条引物将其中所含的15个稀有密码子更换为大肠杆菌偏好的密码子，从而使蛋白质的表达量由占整个菌体总量的7.49%提高到19.8%，这说明稀有密码子确实限制了肠毒素O在大肠杆菌中表达，也证明通过密码子优化来提高肠毒素O的表达水平的策略是成功的。本研究发现，靠近N端的一些稀有密码子对蛋白表达水平影响较为显著，对其优化能较大地提高蛋白的表达水平;同时发现，并不是以上所有稀有密码子，经优化都对蛋白表达水平的提高产生显著影响，即使是同一种稀有密码子在不同位置引起的偏倚对蛋白量的表达水平也会有不同程度的影响。例如在19位的ATA→ATT的突变使蛋白表达量从7.49%提高至10.3%，而在389位 ATA→ATT的突变则对蛋白表达量并没有产生显著影响。此外，有文献报道对表达影响较大的 AGA、GGG等稀有密码子在此体系下对肠毒素O的表达量影响并不是特别显著，这可能与密码子优化顺序或稀有密码子的所处位置有关。有文献报道，在不同位置插入稀有密码子AGG会导致链激酶在大肠杆菌中的过表达或者不表达［14］，提示稀有密码子类型及其所在分子环境(位置)共同决定了该稀有密码子对蛋白表达水平的作用程度。

本实验采用了亲和层析、阴离子层析、超滤等方法，并通过Western blot鉴定，获得了纯度较高的目的蛋白。此方法较为简单、快捷，有助于质量标准的建立以及减少毒副反应。而淋巴细胞增殖试验表明，采用不同方式获得的重组肠毒素O同样具备超抗原活性。

综上所述，本实验通过密码子的优化，较大幅度提高了肠毒素O在大肠杆菌中的异源蛋白表达水平，证实了稀有密码子对蛋白质表达水平确实存在一定的影响，并且提出了假设:稀有密码子类型及其所在分子环境(位置)共同决定了该稀有密码子对蛋白表达水平的作用程度，通过生物学实验对所得蛋白进行了活性鉴定，为大肠杆菌中异源蛋白表达、SEO作用机制的进一步研究，以及靶向资料奠定了基础。

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Codon optimization of recombinant staphylococcal enterotoxin O enhances the expression level in Escherichia coli

HUANG Peng，SUN Hong-ying，CHEN Shu-qing
(Institute of Pharmacology，Toxicology and Biological Pharmaceutics，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou，310058，China)

Objective:To enhance the expression level of staphylococcal enterotoxin O(SEO)by optimization of rare codons.Methods:The gene of mature SEO(His-tag included)was cloned to pET28a，and 15 rare codons on the gene were optimized by PCR technology.These recombinant plasmids then were transformed into E.coli BL21(DE3)，respectively.After IPTG induced，the expression levels of those mutants were analyzed by SDS-PAGE.The proteins were purified and their bioactivities were determined.Results:After the optimization of rare codons，the expression levels were increased from 7.49%to 19.8%in total cell proteins.The optimized SEO had bioactivity to stimulate the proliferation of murine lymphocytes，which was equivalent to that of non-optimized SEO in vitro.Conclusion:Optimization of rare codons can enhance the expression of SEO effectually.

Staphylococcus aureus/immunol;Enterotoxins/immunol;Codon;Gene expression;Genetic vectors;Plasmids;Mutation;Cell proliferation;Lymphocytes

Q 343

A

1008-9292(2011)03-0297-07

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.03.012

2010-10-18

2011-03-31

黄 鹏(1987-)，男，硕士研究生.

陈枢青(1961-)，男，博士生导师，主要从事微生物与生化制药研究;E-mail:chenshuqing@zju.edu.cn

［责任编辑 黄晓花］