HPLC测定玄参中哈巴俄苷和肉桂酸

龙 澜,帅超群

(1.湖北省农业科学创新中心鄂西综合实验站，湖北 恩施 445000； 2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

玄参属玄参科植物玄参(ScrophularianingpoensisHemsl)[1]的根据《神农本草经》记载,玄参具有滋阴、降火、生津、凉血、解毒等功效.用于目赤、痈肿疮毒、热病伤阴、舌绛烦渴等症.现代医学研究表明，玄参还具有抗炎[2]、抗菌[3-4]、保肝用抗氧活性[5]、降压[6]、免疫促进[7]和镇痛[8]等作用.采用反相高效液相色谱法, 比较了不同产地玄参中哈巴俄苷和肉桂酸的含量, 现将结果介绍如下.

1 仪器与试药

Waters高效液相2996；Waters 2996 PD二级管阵列检测器；KQ-250D型超声波清洗器；哈巴俄苷、肉桂酸对照品(成都普思生物科技有限公司，批号：Ps08060501，Ps08092502)，色谱乙腈，去离子水，甲醇、乙酸乙酯，丙酮等试剂均为分析纯，玄参样品采自湖北巴东、湖南龙山、重庆南山、贵州道真、陕西镇平.

表1 流动相梯度洗脱比例Tab.1 The proportion of gradient in the mobile phase

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:依利特C18色谱柱(4.6×200 mm，5 μm)，流动相:乙腈，1%醋酸溶液，按表1进行梯度洗脱.

流速:1.0 mL·min-1；检测波长:278 nm；柱温:25℃，理论板数按哈巴俄苷峰计算不得低于5 000.

图1 哈巴俄苷、肉桂酸对照品 图2 玄参样品 Fig.1 The reference substance of Arpagoside and cinnamic Acide Fig.2 The sample of Figwort root and Cinnamic Acid

2.2 对照品溶液的制备

取哈巴俄苷，肉桂酸对照品适量，用30%甲醇分别配置成含哈巴俄苷300 μg/mL，肉桂酸500 μg/mL的对照品溶液.

2.3 供试品的制备

精确称取玄参药材(粉碎过4号筛) 0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密称定，分别精密加入30%甲醇50 mL、超声波提取50 min，过滤，定容于50 mL容量瓶中，摇匀，作为供试品.

2.4 线性关系的考察

取对照品溶液,按照2.1的色谱条件, 分别进样2、5、10、20、40 μL，以峰面积(A)对浓度(C)回归分析，得哈巴俄苷标准曲线回归方程：A=15.83x+27.58,相关系数r=0.999 91；肉桂酸标准曲线回归方程：A=36.32x+8.97,相关系数r=0.999 95；结果表明,哈巴俄苷和肉桂酸在此条件下呈良好的线性关系.

表2 添加回收率实验

2.5 精密度试验

按照2.1的色谱条件连续进同一供试品溶液5次，测定哈巴俄苷峰面积的RSD为1.93%，肉桂酸面积的RSD为1.67%.

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，按每2 h测定一次，供试品中哈巴俄苷峰面积的RSD为1.21%(n=7) ，肉桂酸峰面积的RSD为1.34%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定.

2.7 重复性试验

取玄参药材5份，按照2.3的方法平行制备5份供试品，依法测定，计算哈巴俄苷保留时间和峰面积的RSD分别为0.45%，1.32%；肉桂酸保留时间和峰面积的RSD分别为0.39%，1.48%，表明该方法的重复性较好.

2.8 回收率试验

取已知含量的玄参样品约0.5 g，精密称取5份，分别加入等量的对照品，按照2.3的方法进行处理，计算回收率，结果见表2.

2.9 样品的测定

按2.3项下方法操作制得的样品溶液,进样20 μL,在278 nm处检测,玄参样品图2的HPLC色谱图.结果5 种不同产地玄参中哈巴俄苷、肉桂酸的含量如下表3.

3 讨论

1)在对玄参提取溶剂的考察过程中，比较30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯得提取效果，实验发现30%甲醇的提取效果是最好的；并对超声波提取时间进行考察，结果采用超声提取50min为最佳方法.

2)通过对哈巴俄苷、肉桂酸的三维扫描，在278 nm处，哈巴俄苷、肉桂酸的吸收较高，且能与杂质少.

3)本实验所建立的测定玄参中哈巴俄苷、肉桂酸含量的方法，准确度高，操作简便、准确、快速、重复性好、灵敏度高，能准确检测玄参中哈巴俄苷、肉桂酸的含量.

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