潞党参极性和非极性成分HPLC指纹图谱研究

李震宇， 王爱娜， 刘晓节，， 薛水玉，， 秦雪梅，， 郭小青， 张丽增 (山西大学中医药现代研究中心， 太原 030006;山西大学化学化工学院;通讯作者，Tel:035－700，E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

潞党参极性和非极性成分HPLC指纹图谱研究

李震宇1， 王爱娜1， 刘晓节1，2， 薛水玉1，2， 秦雪梅1，2*， 郭小青1， 张丽增1(1山西大学中医药现代研究中心， 太原 030006;2山西大学化学化工学院;*通讯作者，Tel:0351－7011202，E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

目的 研究并建立潞党参药材极性和非极性成分HPLC指纹图谱，为党参质量控制提供依据。 方法 采用HPLCUV法分别建立潞党药材中极性和非极性成分指纹图谱，色谱条件为:Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm);检测波长分别为266 nm和230 nm;流动相:乙腈－水，分别进行梯度洗脱，对山西不同产地潞党参药材进行分析。 结果 潞党参药材非极性部分指纹图谱有9个共有峰，极性部分指纹图谱有13个共有峰，山西不同产地潞党参极性和非极性指纹图谱相似度较高(＞0.87)。 结论 本文所建立的潞党参药材的HPLC指纹图谱方法简便、准确、重现性好，可作为党参药材质量均一性评价的基础。

潞党参;HPLC; 指纹图谱; 极性成分; 非极性成分

党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf，素花党参 C.Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen 或川党参C.tangshenOliv.的干燥根，具有补中益气、健脾益肺之功效［1］，主产于山西、甘肃、陕西和四川等地。药材商品根据来源和主产区分为东党、潞党、台党、西党和条党等［2，3］。潞党的原植物为党参，主产于山西晋东南的陵川、平顺、黎城等地，历来被认为是党参的道地药材。目前在山西平顺县和陵川县已建成了潞党质量管理规范(GAP)种植基地。党参主要化学成分有多糖、党参苷、甾醇类、三萜类、生物碱、内酯类、香豆素类等［3－6］，药理实验表明党参中含有的苍术内酯Ⅲ具有明显的抗炎活性，党参苷I具补气功效［5，6］。目前对党参的质量评价研究包括以薄层扫描法测定甾醇类、三萜类［3］，HPLC 法测定党参炔苷［7］、苍术内酯Ⅲ［8－10］等的含量。中药指纹图谱技术的整体性和模糊性，与中医理论的整体性和模糊性相一致，近年来，中药指纹图谱在中药材均一性评价方面已显示出独特的优势。目前，已有文献对川党［11，12］、甘肃白条党［13］进行了指纹图谱研究，而对于潞党指纹图谱的研究未见文献报道。王秀文等［14］对不同生长年限的山西党参进行了指纹图谱研究，可明显区分不同生长年限党参样品，但是该指纹图谱共有峰较少，不能作为潞党的特征指纹图谱。党参化学成分结构类型多样，成分复杂，在同一波长下进行指纹图谱分析难以同时表征所有成分。本实验应用高效液相色谱法，针对极性与非极性成分的化学特点，首次对潞党的极性与非极性成分进行指纹图谱研究，并分别建立不同的色谱条件，结果表明所建立的方法灵敏，可操作性强，重现性好，可作为党参药材极性与非极性成分指纹图谱研究的基础，并为潞党参的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 药品与试剂 苍术内酯Ⅲ(上海中药标准化研究中心)，党参苷Ⅰ(自制);乙腈为色谱纯(北京迪马公司);其他试剂均为分析纯。党参样品共计12个经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为党参原植物正品Codonopsispilosula(Franch.)Nannf，样品收集见表 1。

表1 党参药材来源Tab 1 Studied samples of Radix Codonopsis

1.2 仪器 高效液相色谱仪(美国 Waters，Breeze系统，1 525泵，2 487紫外检测器)，Breeze色谱工作站;Diamonsil C18(5 μm，200 mm ×4.6 mm)色谱柱(DIKMA公司);Sartorious电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

2 方法与结果

2.1 潞党参非极性成分指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长:230 nm;流速:1.0 ml/min;柱温25℃;流动相:乙腈A－水B，梯度洗脱(0－10 min，40%A;10 －15 min，40%A －50%A;15－25 min，50%A;25 －30 min，50%A －68%A;30－45 min，68%A;45 －50 min，68%A －100%A;50 －60 min，100%A)。

2.1.2 样品溶液的制备与测定

2.1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取苍术内酯Ⅲ对照品适量，加甲醇制成96 μg/ml的溶液。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 取党参药材粗粉5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加石油醚(60－90℃)50 ml超声提取30 min，放冷，滤过，滤液回收，水浴蒸干，甲醇溶解并定容至5 ml，摇匀，备用，临用前过 0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.1.2.3 样品测定 取样品溶液20 μl注入高效液相色谱仪，230 nm检测，记录60 min内的色谱峰及其保留时间和峰面积。

2.1.3 方法学考察 按照《中国药典》2010年版一部中药质量标准分析方法验证指导原则的要求，对上述方法进行方法学验证。

2.1.3.1 稳定性 取陵川党参2号样品制备供试品溶液，分别在 0，2，4，8，16 h 检测指纹图谱，结果表明，≥5%总峰面积的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品在8 h内稳定性良好，符合指纹图谱研究技术要求。

2.1.3.2 精密度 取陵川党参2号样品制备的供试品溶液，连续进样5次，结果表明≥5%总峰面积的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明精密度良好，符合指纹图谱研究技术要求。

2.1.3.3 重复性 取陵川党参2号样品5份，平行制备5份供试品溶液，分别检测指纹图谱，结果表明≥5%总峰面积的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品制备方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术要求。

2.1.4 样品测定及指纹图谱共有模式建立 按照

2.1.1色谱条件测定了12批党参药材非极性部分的指纹图谱，山西栽培潞党参药材非极性部分的典型指纹图谱见图1。

在选定条件下，色谱图相邻两峰分离度之和∑R与色谱峰总峰面积之和∑S均为最大，理论塔板数按苍术内酯Ⅲ峰计算不低于20 000。

选取山西栽培潞党样品1－10号，用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”来推导潞党非极性指纹图谱的共有模式，以山西陵川黄松背(GAP种植基地)的色谱图作为参照谱对10批不同潞党的色谱图进行自动匹配(图2)，构建潞党参非极性成分指纹图谱(R谱图)，对1－10号样品的各个峰进行比对分析，共找到9个共有峰，将苍术内酯Ⅲ作为S峰。取S峰为参照峰，以各共有峰的保留时间分别除以参照峰的保留时间计算1－8号峰及S峰的相对保留时间(min，±s)，分别为 0.132 8 ±0.012 7(1)，1(S)，1.470 9 ±0.004 0(2)，1.498 7 ±0.004 4(3)，1.734 3 ±0.005 3(4)，1.914 6 ±0.005 2(5)，1.948 0 ±0.005 9(6)，2.451 8 ±0.011 7(7)，2.737 6 ±0.014 8(8)。

图1 潞党参药材1号样品非极性部分HPLC指纹图谱(S峰为苍术内酯Ⅲ峰)Fig 1 HPLC fingerprint of nonpoalr constituents of Radix Codonopsis(S-atractylenoideⅢ)

图2 10批党参药材匹配后HPLC指纹图谱Fig 2 Fingerprint of 10 batches of samples

在中药色谱指纹图谱相似度评价软件中使用夹角余弦法进行相似度计算，相似度评价结果见表2。

表2 10批党参药材相似度结果Tab 2 Results of similarity of 10 batches of Radix Codonopsis samples

结果显示，1－10号样品中，除7号样品外，9批党参药材与共有指纹图谱的相似度均大于0.90，而1、2、3、5、6、10 号样品与共有指纹图谱的相似度均高于0.95，说明山西栽培潞党参药材的非极性成分具较好的一致性。7号样品与共有模式的相似度较低，仅为0.87，这种差异有待于进一步增加样本数研究。

用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件处理，将山西10批栽培潞党药材生成的指纹图谱共有模式与方山野党及甘肃陇西党参比较，结果见图3及表2。

图3 方山野党、甘肃陇西党参与10批药材生成的指纹图谱共有模式比较Fig 3 Fingerprint of Fangshan sample(S11)，Gansu sample(S12)and reference fingerprint of 10 batches

由11与12号样品的相似度结果可见，方山野党、甘肃陇西党参非极性部分色谱图和2.1.4生成的潞党非极性指纹图谱共有模式有较大差异，其苍术内醋Ⅲ峰面积均明显小于山西栽培潞党，与指纹图谱共有模式相似度分别仅为0.22和0.44，其原因在于这2份党参均为非道地产区党参，与山西栽培潞党在非极性成分上差异巨大。由于本次实验样本数有限，这种差异有待增加样本数进一步研究。

2.2 党参极性成分指纹图谱研究

2.2.2 样品溶液的制备与测定

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取党参苷Ⅰ对照品适量，加50%甲醇溶解，摇匀，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取2.1.2项下石油醚提取后烘干的药渣，加入50 ml甲醇，超声30 min，滤过，滤液回收，水浴蒸干，蒸馏水溶解，正丁醇萃取(20 ml，20 ml，20 ml)，收集正丁醇层，挥干，甲醇溶解并定容至 5 mL，摇匀，备用，临用前过0.45 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。

2.2.2.3 样品测定 取样品溶液20 μl注入高效液相色谱仪，266 nm检测，记录60 min内的色谱峰及其保留时间和峰面积。

2.2.3 方法学考察 按照《中国药典》2010年版一部中药质量标准分析方法验证指导原则的要求，对上述方法进行方法学验证。

2.2.3.1 稳定性 取陵川党参2号样品制备供试品溶液，分别在 0，2，4，8，16 h 检测指纹图谱，结果表明，≥5%总峰面积的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品在16 h内稳定性良好，符合指纹图谱研究技术要求。

航务人员（负责航展布置等）：“我们就天天跟那老外Yes,No的……公司要能提供免费培训那肯定好，那肯定参加，大家都愿意，毕竟你那个要对话嘛，就口语，写作啥的都不管用……”。

2.2.3.2 精密度 取陵川党参2号样品制备的供试品溶液，连续进样5次，结果表明≥5%总峰面积的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明精密度良好，符合指纹图谱研究技术要求。

2.2.3.3 重复性 取陵川党参2号样品5份，平行制备5份供试品溶液，分别检测指纹图谱，结果表明≥5%总峰面积的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明样品制备方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术要求。

2.2.4 样品测定及指纹图谱共有模式建立 按照2.2.1色谱条件测定了12批党参药材极性部分的指纹图谱，潞党参极性部分指纹图谱见图4。

在选定条件下，色谱图相邻两峰分离度之和∑R与色谱峰总峰面积之和∑S均为最大，理论塔板数按党参苷Ⅰ峰计算不低于4 000。

选取山西栽培潞党样品1－9号，用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”来推导潞党极性指纹图谱的共有模式，以山西陵川黄松背(GAP种植基地)的色谱图作为参照谱对9批不同潞党参的色谱图进行自动匹配(图5 )，构建潞党参极性成分指纹图谱(R谱图)。

图4 潞党参药材1号样品极性部分HPLC指纹图谱(S为党参苷Ⅰ峰)Fig 4 HPLC fingerprint of polar constituents of No.1 sample of Radix Codonopsis(S-tangshenosideⅠ)

图5 9批党参药材极性成分匹配后HPLC图谱Fig 5 HPLC fingerprint of 9 batches of samples(R-reference fingerprint)

对各样品的各个峰进行比对分析，共找到13个共有峰，将党参苷Ⅰ作为S峰。取S峰为参照峰，以各共有峰的绝对保留时间分别除以参照峰的保留时间计算1－12号峰及S峰的相对保留时间(min，±s)，分别为0.514 4 ±0.005 9(1)，0.731 1 ±0.008 7(2)，0.804 9 ±0.010 0(3)，0.900 2 ±0.013 3(4)，1(S)，1.380 6 ±0.012 0(5)，1.657 1 ±0.013 2(6)，1.752 3 ± 0.014 7(7)，1.947 7 ± 0.015 0(8)，2.111 9 ± 0.017 4(9)，2.993 1 ± 0.030 4(10)，3.164 6 ±0.031 9(11)，3.467 7 ±0.034 7(12)。

在中药色谱指纹图谱相似度评价软件中使用夹角余弦法进行相似度计算，相似度评价结果见表3。

表3 9批党参药材相似度结果Tab 3 Results of similarity of 9 batches of Radix Codonopsis samples

结果显示，1－9号样品中，除9号药材外，其余8批党参药材与潞党极性成分指纹图谱共有模式之间的相似度均大于0.96，表明9批潞党参药材的极性成分也具有较好的一致性。9号样品与共有模式的差异较大，其相似度仅为0.86，这种差异有待于进一步增加样本数研究。

用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件处理，将山西9批栽培潞党药材生成的极性成分指纹图谱共有模式与方山野党及甘肃陇西党参比较，结果见图6。

图6 方山野党、甘肃陇西党参与9批药材生成的共有图谱比较Fig 6 Fingerprint of Fangshan sample(S11)，Gansu sample(S12)and reference fingerprint of 9 batches

11 与12 号样品的相似度结果显示，方山野党、甘肃陇西党参极性部分色谱图和2.2.4生成的潞党参极性指纹图谱共有模式有一定差异，与指纹图谱共有模式相似度分别为0.86和0.85，说明这2份非道地产区的党参样品与山西栽培潞党在极性成分上有一定差异。由于本次实验样本数有限，这种差异有待增加样本数进一步研究。

3 结论和讨论

3.1 由于党参的化学成分复杂，结构类型多样，极性和非极性成分差异较大，在一个固定波长下进行指纹图谱分析难以表征所有化学成分，本文首次对极性和非极性成分分别进行提取并建立HPLC指纹图谱。

3.2 非极性部分的常用提取溶剂有乙醚、氯仿、石油醚等，考虑到乙醚及氯仿的毒性，选择石油醚为提取溶剂，对石油醚提取后药材中剩余极性成分的提取考察了95%乙醇和甲醇的提取效果，结果表明以甲醇作为提取溶剂所得到的峰分离较好，因此选择了甲醇作为提取溶剂。对于提取方法，考察了超声与回流提取对HPLC指纹峰的影响，结果发现回流与超声提取两者色谱图相差不大，由于超声提取操作简单，便于多个样品平行操作，选择超声提取作为提取方法。对提取时间，考察了15 min，30 min和45 min的提取效果，发现30 min与45 min色谱峰数量及大小区别不明显，所以提取时间定为30 min。

3.3 对Hypersil C18和 Diamonsil C18色谱柱的考察结果表明，Diamonsil C18色谱柱分离效果较好，故选用Diamonsil C18色谱柱;实验过程中对乙腈－水和甲醇－水线性梯度洗脱进行了流动相考察，结果显示乙腈－水线性梯度洗脱效果最佳;非极性成分指纹图谱研究中，通过对220 nm，230 nm，240 nm，254 nm，274 nm，284 nm，311 nm 波长进行实验比较，发现230 nm下的色谱峰数目较多，基线稳定，分离效果较好，故选择230 nm作为检测波长;极性成分指纹图谱研究中，通过对254 nm，266 nm，284 nm，305 nm波长进行实验比较，发现266 nm下党参苷Ⅰ吸收度大，色谱图分离效果好，峰形对称，故选择266 nm为指纹图谱的检测波长。

对党参极性及非极性成分指纹图谱均进行了80 min色谱图的测定，谱图显示，60 min后无色谱峰出现，故检测时间定为60 min。

3.4 方法学考察表明，稳定性、精密度、制备方法重复性均符合指纹图谱分析技术要求，潞党中极性和非极性成分的指纹图谱中分别确定了13和9个共有峰。中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件分析结果表明山西栽培潞党参的极性和非极性成分均具有较好的一致性，所建立的HPLC指纹图谱可作为山西潞党参的特征图谱，该分析方法能够更全面、有效地评价不同产地党参药材内在质量的均一性。

3.5 通过对潞党极性与非极性成分指纹图谱研究，发现山西栽培党参与山西方山野党、甘肃栽培党参极性成分相似，而非极性成分存在较大差异，原因可能是方山野党和甘肃陇西党参的生长条件与山西潞党不同，然而本次实验中样本数较少，这种差异有待增加样本数进一步研究。

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Study on HPLC fingerprint of polar and nonpolar components in Radix Codonopsis

LI Zhen-yu1，WANG Ai-na1，LIU Xiao-jie1，2，XUE Shui-yu1，2，QIN Xue-mei1，2*，GUO Xiao-qing1，ZHANG Li-zeng1，(1Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan 030006，China;2College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi University;*Corresponding author，E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

ObjectiveTo establish the fingerprint of polar and nonpolar components in Radix Codonopsis for providing a basis for quality control of Radix Codonopsis.MethodsFingerprints of polar and nonpolar components in Radix Codonopsis were established by HPLC-UV on Diamonsil C18column(200 mm ×4.6 mm，5 μm)gradiently eluted with acetonitrile-water.The detection wavelengths were 266 nm and 230 nm，respectively.ResultsNine and thirteen common peaks were found in the fingerprint of nonploar and polar components，respectively.The similarity of fingerprints ofCodonopsis pilosula(Franch.)Nannf from Lingchuan，Shanxi Province was higher(＞0.87).ConclusionThe HPLC fingerprint established in this study is convenient，accurate and reproductive，and could be used as the evaluation basis for quality homogeneity ofCodonopsis pilosula(Franch.)Nannf.

Radix Codonopsis;HPLC;fingerprint;polar components;nonpolar components

R927

A

1007 －6611(2011)01 －0056 －07

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.015

山西省科技攻关基金资助项目(052018)

李震宇，男，1980－03生，博士，讲师，E-mail:lizhenyu@sxu.edu.cn.

2010－10－08］