人参皂苷Rg1拮抗MPTP诱导小鼠黑质中铁增高的作用

杨海东， 林碧莲 (莆田学院医学院生理学教研室， 莆田 3500;莆田学院医学院附属医院保健科)

人参皂苷Rg1拮抗MPTP诱导小鼠黑质中铁增高的作用

杨海东1， 林碧莲2(1莆田学院医学院生理学教研室， 莆田 351100;2莆田学院医学院附属医院保健科)

目的 研究人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)对1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶(1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)致帕金森病(Parkinson’s disease，PD)小鼠黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性的保护作用及其可能机制。 方法 C57BL6小鼠随机分为正常对照组(NS，i.p.)、MPTP组(30 mg/kg×5 d，i.p.)及 Rg1(5 mg/kg×8 d，i.p.)预处理组。应用免疫组织化学法、Perls’铁染色、逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)以及图像分析等技术观察黑质内多巴胺转运蛋白(dopamine transporter，DAT)免疫反应活性变化、铁染色阳性细胞数的变化和DAT mRNA的表达水平的变化，用高效液相色谱法(HPLC)检测小鼠纹状体内DA及其代谢物二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)含量。 结果 与正常对照组相比，MPTP组黑质内铁染色阳性细胞数增高以及纹状体内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量明显减少;与MPTP组相比，Rg1预处理组黑质内铁染色阳性细胞数降低以及纹状体内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量明显增加(P＜0.01)。与正常对照组相比，MPTP组黑质内DAT免疫反应活性和DAT mRNA的表达明显降低(P＜0.01);与MPTP组相比，Rg1预处理组黑质内DAT免疫反应活性和DAT mRNA的表达有所增高(P＜0.05)。 结论 Rg1对MPTP致PD小鼠黑质DA能神经元的损伤具有一定的保护作用，其机制可能与Rg1能通过降低MPTP诱导的铁过多聚积从而拮抗氧化应激反应有关。

帕金森病;1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶; 人参皂苷Rg1; 多巴胺转运蛋白; 铁

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是一种常见的中老年人中枢神经系统慢性退行性疾病，严重影响病人生存质量，50岁以上人群发病率约1% －2%［1］。PD主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性变性、脱失及伴发黑质(substantia nigra，SN)、纹状体(striatum)轴突末梢DA耗竭，从而导致基底节神经功能的紊乱［2］。早在1924年就有学者发现PD病人黑质中铁含量明显高于正常人，随着研究的进展，人们逐渐认识到铁在PD的发病机制中起到关键的作用［3］。多巴胺转运蛋白(dopamine transporter，DAT)是中枢DA能神经元突触前膜的一种膜蛋白，是突触前膜再摄取释放至突触间隙DA的物质基础，是反映含DA神经末梢部位活性的良好指标［4］。

目前，PD的治疗多采用DA的替代疗法即服用DA的前体左旋多巴，来弥补脑内DA不足，以改善临床症状，但这并不能阻止DA能神经元的继续凋亡，而且DA本身也可诱导神经元的凋亡，左旋多巴的这些副作用也极大地限制了它的应用。人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)是近年来研究较多的一种人参单体，药理研究表明它具有抗神经细胞凋亡、抗衰老、抗氧化、提高免疫力和类雌激素等作用［5，6］。故实验旨在进一步探讨人参皂苷Rg1对黑质内DA的保护作用并探讨其可能机制。

1 材料

1.1 动物 健康雄性C57BL小鼠，10－12周，体重(21±2)g，雄性，36只，购自北京维通利华动物实验中心，动物合格证号:SCXK(京)2002－0003。

1.2 药物与试剂 MPTP、DA、DOPAC、HVA、DAT抗体(Sigma公司)，人参皂苷Rg1(美国LKT Laboratories公司产品)，DAB试剂盒(北京中杉试剂公司)，Trizol试剂(GIBCO公司)，逆转录试剂盒(PROMEGA公司)，Tag DNA聚合酶、DNA Marker-DL2000(TAKARA公司)。

1.3 仪器 台式低温离心机(德国Eppendorf产品);DNA thermal cycler(Peltier公司);电泳仪(Amershan Pharmacia Biotech公司产品);紫外凝胶成像系统及分析软件(上海天能Tanon公司产品);冰冻切片机(德国Leitz公司制造);高效液相色谱仪(美国Waters公司产品)。

2 方法

2.1 分组与给药 将小鼠随机分为3组，每组12只，其中6只用于断头取脑纹状体和黑质活组织，6只用于脑灌注固定做脑切片。置于室温(19±2)℃，12:12 h昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食。动物于实验前适应实验室环境一周。MPTP模型组:每天上午10:00腹腔注射(i.p.)MPTP(30 mg/kg)，连续5 d;Rg1预处理组:每天上午8:00先行腹腔注射Rg1(5 mg/kg)，连续3 d，其后于上午8:00腹腔注射Rg1(5 mg/kg)及10:00腹腔注射MPTP(30 mg/kg)，连续5 d;正常对照组:腹腔注射等体积生理盐水溶液。

2.2 免疫组织化学(IHC)测定 于末次注射24 h后用8%的水合氯醛腹腔注射麻醉，400 mg/kg，将小鼠深度麻醉后断头取脑固定，修整中脑组织块进行冠状连续冰冻切片，参照试剂盒说明进行DAT免疫组织化学染色。

2.3 铁染色 上述切片同样用于Fe3+的染色。切片在含有2%HCl与2%亚铁氰化钾等体积混合液(新鲜配置)30 min，PBS冲洗后浸泡在1%H2O2中去除内源性过氧化物酶，在含有0.25 mg/ml DAB和0.02%(V/V)H2O2的PBS溶液中显色10 min。

2.4 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测脑内DAT mRNA在黑质中的表达

2.4.1 总RNA的提取 于末次注射24 h后将小鼠断头处死快速取出黑质组织，加入Trizol试剂提取总RNA。

2.4.2 逆转录反应(cDNA的合成) 利用逆转录试剂盒要求的标准条件进行RNA逆转录。反应体系为 20 μl，42 ℃反应 1 h，99 ℃加热 5 min，然后快速冷却到4℃以灭活逆转录酶与cDNA结合，反转录得到的cDNA用作PCR反应模板，或暂放－20℃保存。

2.4.3 聚合酶链反应(PCR反应)PCR引物分别参照文献设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(见表1)。采用25 μl反应体系进行扩增，DAT、GAPDH基因的扩增参数为94℃预变性4 min，94℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，反应35个循环，72℃延伸10 min。

表1 DAT、GAPDH基因的引物Tab 1 The primers of DAT，GAPDH genes

2.4.4 PCR产物定量分析 取扩增产物于含溴化乙锭(ethidium bromide，EB)(0.5 μg/ml)的 2% 的琼脂糖凝胶中电泳，80 V，25 min，运用软件对条带进行分析。每份样本分别得到DAT和GAPDH基因的特异性扩增条带，用DAT与GAPDH比值表示DAT基因的表达水平。

2.5 高效液相色谱电化学检测法(high performance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)检测纹状体DA及其代谢产物

2.5.1 色谱柱条件 流动相:柠檬酸(H2O)4.202 8 g;乙酸钠6.804 g;EDTA·2Na(2H2O)49.87 mg;八烷基磺酸钠(H2O)(OSA)811.275 mg;二正丁胺(0.17 ml);甲醇 50 ml，用双蒸水(ddH2O)稀释至1 000 ml。最大柱压 2 500 psi，流速 1.0 ml/min，ECD设定电压0.65 V，每一样品检测35 min。

2.5.2 组织样品的预处理 样品转入2.0 ml Eppendorf管中，准确称量，加入冰冷的样品预处理A液 300 μl，冰浴中超声 10 s(1 Hz，即振动 1 s，间歇 1 s，反复4－5次)，冰浴静置 1 h，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取240 μl上清液转入另一 Eppendorf管中再加入120 μl冰冷的预处理B液，涡旋混匀，冰浴静置1 h，4℃12 000 r/min离心20 min后置－80℃冷冻保存待测。

2.6 统计学分析实验结果以±s表示，应用SPSS12.0软件包进行单因素方差分析(one-way ANOVA)中Student-Newman-Keuls法检验。

3 结果

3.1 Rg1对MPTP PD模型小鼠DAT免疫反应活性影响 MPTP模型组与正常对照组相比，黑质内DAT免疫反应活性降低了53.8%(P＜0.01)，铁染色阳性细胞数明显增多(P＜0.01);经Rg1预处理后上述结果较模型组有所改善(P＜0.01)，但DAT免疫反应活性仍低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2、图1、图2。

表2 Rg1对MPTP PD模型小鼠黑质区DAT免疫反应活性铁染色阳性细胞数的影响(±s，n=6)Tab 2 Effect of Rgl on the DAT immunoreactive staining and iron staining in the substantia sigra of MPTP Parkinson disease mice(±s，n=6)

表2 Rg1对MPTP PD模型小鼠黑质区DAT免疫反应活性铁染色阳性细胞数的影响(±s，n=6)Tab 2 Effect of Rgl on the DAT immunoreactive staining and iron staining in the substantia sigra of MPTP Parkinson disease mice(±s，n=6)

组别 DAT免疫反应结合率%铁染色阳性细胞数正常对照组2.47 ±0.07 12.04 ±1.35 MPTP 模型组 1.14 ±0.08* 33.18 ±2.56*Rg1 预处理组 1.93 ±0.07*# 17.54 ±2.09*#

与正常对照组相比，*P＜0.01;与MPTP模型组相比，#P＜0.01

图1 小鼠黑质内DAT免疫组织化学染色(40×10)Fig 1 DAT expression in the substantia nigra of mice(40×10)

图2 小鼠黑质内铁免疫组织化学染色(40×10)Fig 2 Iron staining in the substantia nigra of mice(40×10)

3.2Rg1对MPTP PD模型小鼠 黑质DAT mRNA表达的影响MPTP模型组与正常对照组相比DAT mRNA扩增产物明显减少(0.469 ±0.228vs1.175 ±0.322，P＜0.05);经Rg1预处理后DAT mRNA扩增产物(0.981±0.206)较 MPTP模型组有所增多(P＜0.05)。但经Rg1预处理后与正常对照组相比仍有统计学差异(P＜0.05)，见图3。

3.3 Rg1对MPTP PD模型小鼠纹状体内DA及其代谢产物含量的影响 MPTP模型组DA及其代谢产物DOPAC、HVA的含量与正常对照组相比分别下降了 72.51%，43.85%，65.89%，差异有统计学意义(P＜0.01);Rg1预处理组DA、DOPAC和HVA的含量较MPTP模型组均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05);Rg1预处理组DA、DOPAC和HVA的含量仍低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01，见表 3)。

图3 各组鼠黑质内DAT cDNA扩增产物电泳图Fig 3 Amplified products of DAT cDNA in substantia sigra of mice by electrophoresis

表3Rg1对MPTP PD模型小鼠纹状体内DA及其代谢产物含量的影响(ng/mg，±s，n=6)Tab 3Effect of Rgl on the contents of DA and its metabolites in the striatum of MPTP PD model mice(ng/mg，±s，n=6)

表3Rg1对MPTP PD模型小鼠纹状体内DA及其代谢产物含量的影响(ng/mg，±s，n=6)Tab 3Effect of Rgl on the contents of DA and its metabolites in the striatum of MPTP PD model mice(ng/mg，±s，n=6)

与正常对照组相比，*P＜0.01;与MPTP模型组相比，#P＜0.05

组别DA DOPAC HVA正常对照组17.672 ±1.095 2.148 ±0.137 1.202 ±0.115 MPTP 模型组 4.857 ±0.549* 1.206 ±0.071* 0.410 ±0.048*Rg1 预处理组 12.025 ±1.161*# 1.638 ±0.403*# 0.911 ±0.086*#

4 讨论

MPTP可导致黑质－纹状体系统内DA能神经元的损伤、线粒体能量耗竭和氧化应激反应等作用，并且它已作为一种可用于诱导制备PD模型并能模拟出人类PD症状的神经毒性物质有几十年了［7，8］。儿茶酚胺降解酶、单胺氧化酶B可将MPTP转变成有毒性的代谢产物MPP+。DA能神经元末梢可通过细胞膜上的DAT特异性摄取MPP+，因此MPTP的毒性作用不仅作用于纹状体，而且还可以作用于黑质。MPP+可通过在线粒体内膜堆积从而抑制复合物NADH脱氢酶的活性，干扰氧化磷酸化作用，阻断了电子传递而减少ATP的合成导致ATP不足，从而导致DA能神经元损伤。

DA的代谢不仅可通过神经末梢突触前膜的DAT作用被重摄取至囊泡中贮存，还可通过儿茶酚胺氧位甲基转移酶和单胺氧化酶B被代谢成为DOPAC和HVA。正常生理情况下，突触间隙DA功能的消失主要是通过前者实现的。DAT是位于中枢DA神经元突触前膜的一种膜蛋白，属于Na+、Cl－依赖性膜转运体基因家族，是调节和维持DA神经递质的重要因子，它的功能活动、密度变化反映了DA递质系统功能［9］。近年来的研究表明，早期PD患者的DAT水平明显降低，临床研究也显示DAT的改变与PD的严重程度有着良好的相关性，早期PD病人的基底节区DAT就较正常下降了31%－65%;研究还表明，DAT合成并表达于DA能神经元胞体、树突、轴突，然后被运输到树突膜、轴突膜上，因而中脑黑质区具有较高的DAT mRNA转录［10］。本实验也观察到MPTP可造成小鼠黑质内DAT免疫反应活性下降了53.8%以及DAT mRNA的表达下降，与上述结果相符。同时，本实验结果还表明，MPTP可导致小鼠纹状体中DA及其代谢产物DOPAC、HVA 的含量分别下降 72.51%，43.85%，65.89%。应用Rg1处理后上述指标有所改善，说明Rg1对DA神经元具有保护作用。

在体内铁是一种重要的微量金属元素，它在氧的转运、电子传递和DNA合成等生物学功能中起着重要的作用。实验研究表明在黑质内，DA由单胺氧化酶B诱发的氧化脱胺及自身氧化生成黑色素的过程中都能产生H2O2。由Fe3+还原生成的Fe2+可与H2O2反应，再通过Fenton反应，H2O2+Fe2+→OH·+OH－+Fe3+，生成具有高度细胞毒作用的OH·，从而造成线粒体和其他细胞成分的损伤导致DA能神经元的死亡［11］。黑质内铁的增多可破坏机体内氧化机制与抗氧化机制之间的平衡，导致氧化应激反应发生，引起细胞损伤;同时在线粒体呼吸链中，氧接受一个电子形成超氧阴离子O2·，O2·在过氧化物歧化酶的作用下可生成H2O2，而O2˙本身可促进Fe3+由其铁结合蛋白上的释放，从而加速了OH·的生成，进一步造成DA能神经元死亡。有相关报道表明MPTP可以通过氧化应激反应而发挥神经毒性作用，这可能与MPTP增高铁积聚密切相关，体外实验也证实Fe2+可以使MPTP转化成MPP+，结果使Fe3+增高，从而产生氧化应激反应并与细胞毒性氧自由基相互作用而导致DA能神经元的损伤［12］。本实验结果显示MPTP可导致小鼠黑质内铁染色阳性细胞数增高，这与本室前期研究结果相符［3，13］，说明 MPTP 可以通过增高铁积聚导致氧化应激从而促使DA能神经元变性死亡。

本研究应用Rg1处理后观察到小鼠纹状体内DA及代谢物含量、黑质内DAT免疫反应活性和DAT mRNA表达水平均比MPTP组明显升高，黑质内铁染色阳性细胞数明显少于MPTP组;我们推测Rg1可能是通过降低MPTP诱导的铁过多聚积从而拮抗氧化应激反应，起到保护黑质DA神经元的作用。

总之，MPTP可导致黑质DA能神经元变性、坏死，Rg1对MPTP致黑质DA能神经元的损伤具有一定的保护作用，其机制可能与Rg1抗氧化应激反应有关。

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The role of ginsenoside Rg1 in antagonism of MPTP-induced iron accumulation in substantia nigra of mice

YANG Hai-dong1，LIN Bi-lian2(1Dept of Physiology，Medical College of Putian University，Putian 351100，China;2Dept of Health Care，The Affiliated Hospital of Medical College of Putian University)

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra in 1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP)treated C57BL6 mice.MethodsMice were randomly divided into three groups:normal group，MPTP group and Rg1 pretreatment group.The mice were injected intraperitoneally with normal saline in normal group，30 mg/kg MPTP for 5 d in MPTP group，and 5 mg/kg Rg1 for 8 d and 30 mg/kg MPTP for 5 d in Rg1 pretreatment group，respectively.RT-PCR，immunohistochemistry，Perls’iron staining were used to observe the immunoreactive staining of dopamine transporter(DAT)protein，iron-positive cells and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，respectively.HPLC was used to detect the contents of dopamine and its metabolites，dihydroxyphenylacetic acid and homovanillic acid in striatum of mice.ResultsThe DAT immunoreactive staining and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，and the contents of dopamine and its metabolites in the striatum were significantly lower in MPTP group than in control group(P＜0.01)，while iron staining was significantly higher(P＜0.01).Compared with MPTP group，the DAT immunoreactive staining and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，and the contents of dopamine and its metabolites in the striatum increased significantly(P＜0.05 orP＜0.01)，while iron staining significantly decreased(P＜0.01).ConclusionGinsenoside Rg1 could protect against the MPTP-induced neurotoxicity of dopaminergic neurons in PD mice by decreasing the MPTP-induced iron accumulation for inhibiting the oxidative stress reaction.

Parkinson’s disease;1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP);ginsenoside Rg1;dopamine transporter;iron

R741.02

A

1007 －6611(2011)01 －0010 －05

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.003

莆田市科技计划项目基金资助项目(2009S02(3))

杨海东，男，1976－02生，硕士，讲师，E-mail:yhdzlx999890@163.com.

2010－11－11］